Eindelijk kunnen we écht binnenin de cel kijken

Supermicroscoop

De cryo-elektronenmicroscoop, die cellen bevriest, jaagt een revolutie aan in de biologie. Verborgen details zijn ineens te zien en vage plaatjes worden haarscherp. De cel blijkt een oerwoud.

Beeld van kernporie, gemaakt met de cryo-elektronenmicroscoop. De kernmembraan van de celkern bevat honderden kernporiën. Jan Kosinski/EBML

Het orakel staat in een kelder van de Universiteit Leiden, op een trillingsvrije betonnen vloer. De Titan-Krios, drie meter hoog, rechthoekig, grijs met zwart. Het is een elektronenmicroscoop, en in zijn binnenste vriest het bijna 200 graden. Titan-Krios kostte evenveel als een rijtje kapitale villa’s. In een lab verderop op de Leidse campus staat nog een tweede exemplaar.

Dit type microscoop, een cryo-elektronenmicroscoop, jaagt momenteel een revolutie aan in de biologie. Biologische structuren die tot nog toe alleen op vage plaatjes te zien waren, of helemaal niet, staan nu in volle glorie op de bladzijden van de toptijdschriften.

Cryo-elektronenmicroscopie brengt cellen of celstructuren in beeld die diepgevroren zijn, alsof ze in hun dagelijkse bestaan verstild zijn. De microscooptechniek stamt uit de jaren 70 en 80, maar is de afgelopen vijf jaar technisch sterk verbeterd. Wereldwijd schaffen biologen nu cryo-elektronenmicroscopen aan – ze kosten 2 tot 8 miljoen euro per stuk – en leggen hun cellen erin.

Zo komen ze erachter dat allerlei onderdelen van de cel er eigenlijk anders uitzien. In celorganellen waarvan plaatjes al tientallen jaren in biologieboeken worden afgedrukt zien ze details die voorheen verborgen bleven. Zelfs ontdekken ze heel nieuwe, onbekende structuren.

Een internationaal gezelschap van cryo-EM-kenners zette in februari een artikel online over ‘onbekende bacteriële structuren’ die ze zagen met de cryo-elektronenmicroscoop. Het artikel staat vol plaatjes. Zoals een bacterie met op de buitenkant een rij tuitjes met vijf pootjes. Verder bacteriën met onbekende haakjes, ringetjes, blaasjes, iets hoefijzervormigs. Wie het weet mag het zeggen.

Cryo-elektronenmicroscopie zorgt ook in Nederland voor grote veranderingen. In hoog tempo worden laboratoria ingericht met een peperdure cryo-elektronenmicroscoop. Door het hele land zijn nieuwe onderzoeksleiders aangetrokken, vanuit het buitenland. De Duitse Ariane Briegel in Leiden, haar landgenoot Friedrich Förster in Utrecht, de Portugese Cristina Paulino in Groningen. Alledrie zijn ze jonger dan 45. „Het was niet de vraag óf het zou aanslaan, maar wanneer,” vertelt de Utrechtse hoogleraar Friedrich Förster.

De cel zoals de cryo-elektronenmicroscopie hem nu in beeld brengt, is een oerwoud. Het is vol, nergens is een open plek die overzicht biedt. Je moet je tussen stapels membranen door worstelen en langs transportdraden. Op elk oppervlak struikel je over draaiende pompen, poorten die open en dicht gaan, automaten die moleculen uitbraken.

Kijk mee in het diepste van de cel

En ergens in die wildernis leven onbekende soorten. De cryo-EM-mensen ontdekken nieuwe poorten, schakelaars, fabriekjes, allemaal gemaakt van eiwit. (Om het leven op de miljoenste millimeter te beschrijven, behelpen we ons met het vocabulaire uit de industrie.)

Apparatuur om de diepste structuur van de cel te verkennen, bestaat al tientallen jaren. De eerste gewone EM-plaatjes dateren uit 1945. Maar die foto’s geven een vertekend beeld. Om tegen traditionele elektronenmicroscopie bestand te zijn, worden cellen geprepareerd: ze worden gedroogd en soms ook ontvet, vaak met metaal ‘gekleurd’ en ingebed in hars of plastic. Cellen lijden daaronder.

Een fundamenteel ándere aanpak die al vroeg in de twintigste eeuw is ontwikkeld, is: interessante eiwit-complexen (de ‘machientjes’ in de cel) isoleren en analyseren. De dominante techniek daarvoor is röntgenkristallografie, al sinds de jaren 30. Later, vanaf de jaren 70, kwam daar kernspinresonantie (NMR) bij, die vooral geschikt is voor kleinere eiwitten.

Bij röntgenkristallografie maakt een biochemicus een regelmatig kristal van het eiwit. Vervolgens wordt dat kristal in een deeltjesversneller bestookt met röntgenstraling. Uit het patroon waarin de straling van het kristal afketst, is de vorm van het eiwit af te leiden.

De 3D-modellen van eiwitten die met röntgenkristallografie gemaakt worden, zijn extreem nauwkeurig. Tegenwoordig wordt regelmatig een resolutie van 1 Ångström (Å, oftewel 0,0000001 millimeter) gehaald. Dat is minder dan de diameter van een koolstof-atoom.

„Maar niemand is er dol op om kristallen te maken”, zegt Förster. „Het is moeilijk en duur.” Er is maar een beperkt aantal deeltjesversnellers in Europa; meettijd is kostbaar. En je hebt er grote hoeveelheden eiwit voor nodig – iets wat ook voor NMR geldt. Maar vooral: eiwitten kristalliseren niet zoals bijvoorbeeld keukenzout. Ze zijn onregelmatig en instabiel. Het lastigst zijn de duizenden verschillende eiwitten die in de olie-achtige membranen van de cel zijn ingebed. Die zijn niet oplosbaar in water, en dat maakt kristallisatie heel lastig.

Blob-ologie

Daarmee vergeleken is het principe van cryo-elektronenmicroscopie nogal eenvoudig. Het preparaat – een dun plakje cel of een verzameling losse eiwitten – wordt pijlsnel diepgevroren. Vervolgens wordt het ‘doorgelicht’ met de elektronenmicroscoop, die van binnen wordt gekoeld met vloeibare stikstof (–196 °C). Zulke koude preparaten zijn bestand tegen het elektronenbombardement van de microscoop. „Als de atomen door de lage temperatuur nauwelijks bewegen, maakt het niet zoveel uit als er een atoombinding kapot gaat”, vat Förster samen.

Het principe werd al in 1974 gedemonstreerd. En in 1982 ontwikkelde een team uit Heidelberg een techniek om preparaten zo snel te bevriezen dat er geen ijskristallen ontstaan – ze ‘verglazen’. Tegenwoordig heeft elk cryo-EM-lab daarvoor een cryo-plunger op de werkbank staan, die preparaten in een bad met vloeibare ethaan of propaan torpedeert.

35 jaar geleden was cryo-EM dus af, in principe. Maar het sloeg niet erg aan. Diepgevroren preparaten zijn alleen bestand tegen een heel lage dosis elektronen. Cryo-EM-plaatjes zagen er daardoor uit alsof je door een dikke mist keek.

In het handboek Practical Protein Crystallography (1993) werden zulke onscherpe plaatjes ‘blobologie’ genoemd – vlekkenkunde. Je kon er niet eens een alfa-helix van een eiwit fatsoenlijk mee onderscheiden. Voor heel symmetrische objecten, zoals virussen, was er nog wel wat van te maken. Maar om heldere afbeeldingen van onregelmatige objecten zoals eiwitcomplexen te maken, moesten honderdduizenden, zelfs miljoenen cryo-EM-beelden over elkaar heen worden gelegd. Er werden in de jaren 90 speciale algoritmen ontwikkeld om dat voor elkaar te krijgen.

En toen werd een baanbrekende technologie uitgevonden, vertelt hoogleraar Ariane Briegel in Leiden, in het halletje naast de Titan-Krios. „De revolutie is aangejaagd door verbeterde detectoren.” Zij en Förster promoveerden beiden aan het Max Planck Instituut in Martinsried, en maakten de revival van cryo-elektronenmicroscopie mee.

Zijzelf maakt cryo-EM-plaatjes van bacteriën, waarbij de hele cel wordt doorgelicht. „Eerder moesten in detectoren elektronen worden omgezet in fotonen. Nu worden de elektronen direct gedetecteerd. Dat is veel nauwkeuriger.”

‘Mooie plaatjes’

Ook worden de computer-algoritmen steeds beter in het digitaal ‘opstapelen’ van die plaatjes. En de modernste detectoren voorspellen op basis van de ‘uitgesmeerde’ afdruk die een elektron veroorzaakt, waar het elektron precies insloeg. Dat maakt de resolutie nog veel beter.

Daardoor kan Briegel, die cholerabacteriën onderzoekt, een cryo-EM-foto maken alsof het een gewone EM-foto is. Zij combineert geen duizenden foto’s van verschillende bacteriën – dat zou een wazig geheel opleveren. Förster, die eiwitcomplexen in hun natuurlijke ‘habitat’ in beeld brengt (en daarbij wel duizenden exemplaren met de computer over elkaar legt), haalt resoluties van 5 tot 9 Å. Geïsoleerde cellulaire machines zijn al met 2-3 Å in beeld gebracht.

Het is nog niet zo precies als bij röntgenkristallografie, maar precies genoeg. Briegel stond in augustus in PNAS; Förster haalde begin dit jaar Nature Communications en Science. Er staan nu wekelijks „mooie plaatjes” uit de cryo-elektronenmicroscoop in de tijdschriften. Ze laten zien hoe cellen werken. Hun biologische klok, hun ‘zintuigen’, hun interne machinerie. De cel is een oerwoud op de vierkante micrometer. Dat woud hebben biologen definitief betreden.

Foto A Briegel/Leidenuniv, ingekleurd

Ariane Briegel, Leiden Maakt de ‘neuzen’ van bacteriën zichtbaar

Wie? Ariane Briegel.

Waar? Ze werkte in Duitsland en de VS. Ze is sinds 2015 hoogleraar ultrastructuur-biologie aan de Universiteit Leiden.

„Elke bacterie heeft een ‘neus’, beter gezegd een systeem voor chemotaxis.” Chemotaxis helpt een bacterie om zijn chemische omgeving waar te nemen, en naar een gunstige plek te zwemmen – bijvoorbeeld bij een infectie.

Het bekendste chemotaxis-systeem is dat van de labbacterie Escherichia coli. Dat is een heel simpel systeem met receptoren voor chemische stoffen. Er zit een geordend veld (een array) van duizenden receptoren aan de ‘voorkant’ van de bacterie, in de celmembraan (de wand van de cel).

Maar veel bacteríën, zoals de cholerabacterie Vibrio cholerae, hebben nog twee andere ‘neuzen’, en veel meer soorten receptoren dan E. coli. Briegel: „Van die systemen hebben we geen idee wat ze doen. Maar door mijn cryo-EM-onderzoek weten we nu wel hoe ze eruit zien.”

Briegels onderzoeksgroep bij Caltech liet zien dat één zo’n ‘neus’ een geordende groep receptoren is die niet in de celmembraan zit, maar los in de cel. Het is de schuine, paarse rechthoek op de EM-foto (boven). De groep publiceerde er een serie artikelen over, het meest recent nog in augustus 2016 in PNAS. Briegel beschreef ook hoe zo’n chemotaxis-array toch geordend in elkaar blijft zitten. Ze zet dit onderzoek nu voort in Leiden. „We weten dat die arrays elk samenhangen met een bepaald deel van de levenscyclus van de bacterie. En verder weten we nog niks.”