ATGCTTTGGTGT

Een nieuwe generatie apparaten analyseert DNA zo snel dat Amerikaanse biotechnologen er hun eigen DNA-volgorde al mee hebben laten bepalen. Marianne Heselmans

De 79-jarige Nobelprijswinnaar James Watson, ontdekker van de DNA-structuur, was 31 mei de eerste die hét cadeau van de toekomst mocht ontvangen: zijn volledig in kaart gebrachte genoom, opgeslagen op twee dvd’s. Hij deed hem heel veel, verklaarde hij op de feestelijke uitreiking in Houston (VS). Genetici hadden in zijn DNA al gezien dat hij gevoelig is voor kanker, zo meldde hij ook. En dat kon Watson bevestigen. Hij zelf had al huidkanker gehad, en zijn zus had nu borstkanker. Alleen over zijn eventuele gevoeligheid voor Alzheimer, waar zijn grootmoeder aan was overleden, wilde hij niks weten. “Die stukken DNA ga ik uit de kaart halen.’’

Watson kreeg de dvd’s op het Bayor Medical College van Jonathan Rothberg, oprichter van het razendsnel gegroeide biotechnologiebedrijf 454 Life Sciences. De uitreiking zag Rothberg als een belangrijke stap naar het apparaat dat in een paar uur voor minder dan duizend dollar een menselijk genoom kan ontrafelen. De Amerikanen zijn al een eind op weg. Hun apparaten hoeven nog maar 1.000 keer goedkoper te worden. Aan Watson’s genoom hebben twintig mensen twee maanden gewerkt en dat kostte een miljoen dollar. Dat was al 3.000 keer goedkoper en 75 keer sneller dan de sequencing van het eerste humane genoom, wat 13 jaar duurde en 3 miljard dollar kostte.

Sequencen is het base na base, ofwel letter na letter, in kaart brengen van DNA. Omdat ons genoom uit zo’n 3 miljard basenparen bestaat, bevatten die twee dvd’s van Watson dus eindeloze rijen van samen 3 miljard letters: ATGCTTT GGTGGGAAGTA etcetera, etcetera. Ergens één verkeerde letter kán een grotere kans betekenen op kanker, of op taaislijmziekte, of op een grote neus… Als straks het sequencen van een menselijk genoom inderdaad nog maar 1000 dollar kost, kunnen ouders de genetische gevoeligheden van hun baby gemakkelijk in kaart laten brengen.

tijd en geld

Dat het sequencen nu zoveel sneller kan, is te danken aan de geheel nieuwe methode die onder andere 454 Life Sciences heeft ontwikkeld (zie kader). Toen het sequencen van het mensengenoom nog 13 jaar duurde, moesten alle stukjes DNA eerst in bacteriën gebouwd worden om zo te worden vermeerderd. Dat hoeft niet meer, wat veel tijd en geld bespaart. Ook kunnen nu in één meting in plaats van enkele tientallen, honderdduizenden DNA fragmenten tegelijkertijd worden geanalyseerd. 454 Life Sciences, dit jaar opgekocht door farmaceut Roche, bracht zijn apparaat in 2005 op de markt. Sindsdien zijn niet alleen zij, maar ook het Amerikaanse Applied Biosystems en Solexa, onlangs gekocht door Illumina, met nog snellere apparaten gekomen.

In Nederland staan nu drie van deze tweede generatie sequencers. Twee ervan staan bij het planten biotechnologiebedrijf Keygene in Wageningen, waar 120 mensen werken. “De ontwikkelingen gaan spectaculair hard”, zegt business manager Mark van Haaren. In een van de laboratoria laten hij en directeur Arjen van Tunen een kunststof plaatje zien, zo groot als een creditkaart. Hierin zitten 1,6 miljoen gaatjes, vertellen ze, met in ieder gaatje een stukje van het te analyseren DNA. Wanneer onderzoekers het door hen gevulde plaatje in het (tafelmodel) apparaat schuiven, lezen ze vier uur later op de computer de DNA-basenvolgorde af.

Van Tunen: “Met de apparatuur verkrijgen we nu 120 miljoen basenparen in vier uur, in plaats van 60.000 in twee uur zoals met de eerste generatie apparatuur.’’ Maar, vertelt hij er ook bij, omdat er in de letterrijen altijd fouten zitten, leest zijn bedrijf alle stukken DNA tien keer. Zo kan het nu twee bacteriën met niet te grote genomen (2 á 3 miljoen basenparen) in één middag betrouwbaar sequencen. Kosten: 18.000 euro. Het kleine genoom van de zandraket – 120 miljoen basenparen – zou het apparaat dus 40 uur kosten (tien keer vier uur), aangenomen dat het de software meteen lukt om zoveel DNA fragmentjes weer netjes in volgorde te krijgen. “Een heel plantengenoom laten sequencen is nog te duur’’, zegt Van Haaren. “Maar we gaan ervan uit dat het uiteindelijk wel naar sequence based breeding toe gaat. Bedrijven laten dan van 50 of 100 tomaten of aardappelen het hele genoom sequencen, en met de beste kruisen ze verder.’’

Keygene heeft behalve van LifeSciences 454, ook een sequencingapparaat van Solexa aangeschaft. Deze leest nog sneller: 1 miljard basenparen in een ‘read’ die drie dagen duurt. Maar dit apparaat werkt alleen als de basenvolgorde van een soort al bekend is, en de software de 40 miljoen parallel geanalyseerde stukjes DNA als het ware tegen de al bekende DNA-kaart kan leggen. De Solexa is dus alleen geschikt om verschillen tussen genomen af te lezen.

Het vergelijken van delen van bijvoorbeeld een tomaten- of aardappelgenoom – tot 1 á 2 procent – is met deze twee apparaten haalbaar geworden, zegt Van Tunen. “En het is nu ook niet meer te duur om commercieel minder aantrekkelijke groentes te sequencen, zoals kool of komkommer.’’

Het Leids Universitair Medisch Centrum heeft ook net een apparaat van Solexa aangeschaft. Onderzoeksleider Johan den Dunnen van het Leiden Genome Technology Center was verbaasd over de belangstelling. “Het apparaat was van meet af aan nagenoeg bezet, wat uitzonderlijk is voor een nieuw apparaat. Meestal hebben onderzoekers in het begin weinig belangstelling, omdat ze nog niet weten wat ze met de technologie moeten aanvangen. Maar nu zitten we tot het einde van het jaar bijna vol.’’ Onderzoekers vergelijken nu bijvoorbeeld één bepaald gen in 500 kankerpatiënten en 500 controles. Welke afwijkingen spelen een rol bij welk type tumoren? Of ze vergelijken 80 genen in een tumor, met 80 genen in gewone cellen. Zulke breed vergelijkende studies zijn met de nieuwe sequencers 5 tot 10 keer goedkoper dan met de ‘oude’ apparaten. Ze zijn nu pas betaalbaar.

Omdat het DNA niet meer in bacteriën hoeft te worden vermeerderd, is ook oud DNA te sequencen. Oud DNA is namelijk vaak te beschadigd om het door bacteriën te laten vermeerderen. Het Max Planck Instituut voor Evolutionaire Antropologie in Leipzig laat nu door Roche/454 Life Sciences het hele genoom van de Neanderthaler sequencen.

Ook zijn nu veel beter de kleine micro-RNA’s te bestuderen. Over deze moleculen, waarvan er honderdduizenden in een cel kunnen zitten, is nog weinig bekend. Men weet dat ze gericht de vertaalslag van genen in eiwitten kunnen blokkeren, en zo de celontwikkeling kunnen beïnvloeden. Maar men weet niet welke vertaalslagen ze nu precies waar en wanneer beïnvloeden. Met de nieuwe sequencing apparaten kan voor een redelijke prijs de basenvolgorde van al die honderden verschillende micro-RNA’s worden opgehelderd, en daarmee ook hun functie.

Het Hubrecht Institute in Utrecht heeft er daarom ook eentje besteld, bij Applied Biosystems (twee miljard basenparen per ‘read’ van drie dagen). “Inderdaad een hele stap’’, zegt onderzoeksleider Edwin Cuppen. “Zo’n apparaat kost een half miljoen euro. En daarnaast heb je analisten en bio-informatici nodig die kunnen helpen bij de proefopzet, en bij de interpretatie van de gegevens. Maar we hebben er toch voor gekozen. Voor ons zijn microRNA’s, en het vinden van mutaties in genen, speerpunten. We zien het als een enabling technology. Als je hem in huis hebt, ontstaan de onderzoeksvragen vanzelf.’’

terughoudend

Wat meespeelt bij de populariteit van deze tweede generatie sequencing apparaten, legt Den Dunnen van het LUMC uit, is de veranderde houding van biologen. Nu is het een standaardtechniek, maar zeven jaar geleden stonden de Leidse onderzoekers aanvankelijk heel terughoudend tegenover de destijds nieuwe micro-array technologie, de DNA chips waarmee men kan achterhalen welke genen actief zijn. Den Dunnen: “Toen zag men het doormeten zonder duidelijke hypothese nog als ‘fishing expedition’: dat deed je niet. Maar dat is veranderd. De houding is nu vooral: ‘eens kijken wat ik allemaal tegenkom’.’’ Zo wordt het Solexa apparaat in Leiden nu niet alleen gebruikt om gericht DNA van patiënten te onderzoeken, maar ook om te kijken welke micro-RNA’s er allemaal te vinden zijn in allerlei weefsel van de muis, rat, kip en mens – ziek en gezond.

De tweede generatie apparaten zijn elke paar maanden weer wat sneller, maar uiteindelijk zijn alle ogen gericht op het ‘duizend dollar genoom’ apparaat, of, voor Europa, het ‘duizend euro apparaat’: het apparaat dat voor maximaal 1000 euro in enkele uren 3 miljard basenparen betrouwbaar kan lezen. Zo’n enorme snelheid en precisie is niet met de huidige apparaten te bereiken: dat vraagt een geheel nieuwe technologie. En daar zijn nu zo’n veertig, vooral Amerikaanse bedrijven en onderzoeksgroepen voor in de race. Sommigen voorspellen dat de machine voor het duizenddollargenoom er over twee jaar is, anderen schatten vijf, en weer andere zeven, maar dát er nog een derde generatie, supersnelle ‘nanotechnologische’ apparaten gaat komen, daar twijfelt geen biotechnoloog aan. Om de zaak aan te jagen heeft de Amerikaanse X- Foundation een prijs van tien miljoen dollar uitgeloofd voor wie het eerst honderd menselijke genomen kan sequencen in tien dagen (http://genomics.xprize.org/).

Het principe ervan wordt waarschijnlijk ‘Single molecular sequencing’. Bij de tweede generatie apparaten wordt het DNA nog vele malen gekopieerd met een enzym, om leesbare hoeveelheden te verkrijgen. Bij ‘single molecular sequencing’ hoeft dat niet meer: het DNA wordt dan als afzonderlijke moleculen gelezen. Eén idee is om miljoenen enkelstrengs DNA moleculen ( DNA is van nature een dubbele streng) tegelijkertijd en razendsnel te leiden door evenveel minuscule nanobuisjes, die zich bevinden in al even minuscuul geladen veldjes. Omdat bijvoorbeeld base A een net even andere invloed op zo'n veldje heeft dan base G of T, zou je moeten kunnen meten welke base op een bepaald moment door het, in het elektrisch veld geplaatste nanobuisje gaat.

Een ander idee is om de dubbele streng door een nanobuis te jassen, op zo’n manier dat de basen aan het begin van die buis kapot gaan, omdat er maar één streng door kan. Op dat moment lichten ze dan op met een bepaald, bij hen passend kleurtje. Zo ver is het nog niet. Al dit soort nanotechnologieën kampen met nog veel technische problemen, zegt Theo Odijk, theoretisch fysicus op de Universiteit Delft. Zo rolt DNA zich al gauw op tot een onontwarbaar bolletje, zeker enkelstrengs DNA.

toplui

Odijk heeft samengewerkt met David Schwartz van de Universiteit van Wisconsin-Madison (VS), die daar met twintig mensen aan zo’n derde generatie apparaat werkt. “Uit de wetenschappelijke artikelen die nu verschijnen’’, zegt hij, “is niet af te lezen dat de ideeën gaan werken. Integendeel zelfs, je moet eruit concluderen dat het helemaal niet gaat lukken. Maar ik neem aan dat de groepen niet het achterste van hun tong laten zien, want uit persoonlijke gesprekken krijg ik de indruk dat ze toch al verder zijn dan uit die publicaties is te halen. Het zijn ook echt de toplui die hier nu mee bezig zijn, zoals op de universiteiten van Harvard en Princeton, en op het instituut van Venter in Rockville; ze krijgen er bakken geld voor, en er is een enorm sterke competitie. Maar die onderzoekers doen het niet voor het geld. Ze doen het om de eer en omdat ze het leuk vinden. Die Schwartz is er heel ontspannen onder. Uiteindelijk zal het dus denk ik wel lukken met nanobuizen. De vraag zal alleen zijn of je daarmee ook zo snel kunt sequencen als nu wordt beloofd.’’

Apparaten waaruit een miljard letters per uur rollen vragen nog meer opslagcapaciteit, en nog slimmere zoekmachines. Maar Odijk verwacht niet dat de informatica een bottleneck zal worden. “De beste wiskundigen in Amerika zijn daar nu mee bezig.’’

Behalve Watsons genoom is er dit jaar nóg een genoom van een individu ontrafeld, en wel dat van de meest ambitieuze biotechnoloog ter wereld: Craig Venter. De ruwe versie is gedaan door het bedrijf Celera Genomics, dat hij in 1999 opzette om de Amerikaanse overheidsinstituten bij de ontrafeling van het humane genoom de loef af te steken; de verfijning door het Instituut voor Genoom Onderzoek (TIGR), dat hij daarna opzette om de eerste synthetische bacterie te maken. Uiteraard was ook Venter bij de feestelijke uitreiking van het genoom van Watson. De beroemde biotechnoloog bleek genetisch gevoelig voor Alzheimer, oorsmeer en hart- en vaatziektes. En nee, zo had hij tegen journalisten gezegd, hij zat er niet mee dat iedereen nu zijn genetische onvolkomenheden kan aflezen. “De analyse is dermate complex, dat mensen uit mijn DNA echt niet mijn persoonlijke eigenaardigheden kunnen verklaren.”

Het genoom van Venter is 4 september – als eerste in de wereld – gepubliceerd in het vrij toegankelijke PLOS Biology; iedereen is door de redactie van PLOS uitgenodigd Venter’s genoom zelf te exploreren op de site 10.1371/journal.pbio.0050254.sd001. Tegen een journalist van U.S. News vertelde Venter begin september dat zijn instituut doorgaat met het sequencen van genomen. Volgend jaar hopen de onderzoekers zo’n dertig tot vijftig mensen te hebben gesequenced.

Bij de publicatie van het genoom van Watson zal een analyse van de sociale en ethische aspecten komen, zo is in Houston beloofd. Daar zullen veel mensen blij mee zijn. Want Watson en Venter kunnen wel weinig problemen hebben met de openbaring van hun genoom, bij andere mensen kan dat anders liggen.