Bibliotheek van het leven

Een nieuwe methode maakt het mogelijk menselijke genen één voor één uit te schakelen. Binnen een halfjaar zijn met de aanpak vijf genen gevonden die kanker onderdrukken.

Vijf nieuwe kankeronderdrukkende genen vonden onderzoekers van het Nederlands Kanker Instituut (NKI) bij de eerste toepassing van een `bibliotheek' met moleculen waarmee ze bijna 8.000 menselijke genen ieder afzonderlijk kunnen uitschakelen. De bibliotheek bestaat uit bijna 24.000 korte haarspeldvormige RNA-moleculen en werkt met de pas ontwikkelde techniek van RNA-interferentie (RNAi).

Tot nu toe hadden de korte interfererende RNA's (siRNA's) hun nut alleen in fruitvliegen en rondwormen bewezen. De NKI-onderzoekers onder leiding van prof.dr. René Bernards hebben nu aangetoond dat zo'n bibliotheek van duizenden goedgekozen kleine RNA-fragmenten ook in celkweken van zoogdier- en mensencellen genen selectief kan uitschakelen. Daardoor is de werking van die genen snel te achterhalen. De siRNA-bibliotheek belooft een standaardwerktuig van het moleculair-biologisch laboratorium te worden. De vijf gevonden potentiële tumorsuppressorgenen zijn een eerste toepassing. Binnen het NKI zijn met de bibliotheek ook al genen opgespoord die bepalen of een chemotherapiekuur met taxol bij een borstkankerpatiënte wel of niet zal aanslaan.

De bouw van de bibliotheek en de eerste toepassing leverde de NKI-groep deze week een publicatie in Nature (25 maart) op. In hetzelfde nummer van Nature staat overigens een soortgelijk artikel van de groep van prof.dr. Gregory Hannon van Cold Spring Harbor Laboratory in New York. Deze groep maakte eveneens een bibliotheek van siRNA's waarmee 9610 mensengenen selectief kunnen worden uitgeschakeld.

De vijf gevonden genen doen mee in het regelmechanisme van het beroemde tumorsuppressorgen p53 (zie kader). Dat is in de helft van alle tumoren gemuteerd, waardoor kankercellen ongecontroleerd kunnen delen. De vondst van de vijf illustreert het tempo van kennistoename nadat het hele menselijk genoom enkele jaren geleden in kaart werd gebracht (het post-genoom-tijdperk). Er zijn al veel tumorsuppressorgenen bekend, maar tot voor kort deden tientallen onderzoekers er jaren over om er één te vinden. Onder leiding van prof.dr. René Bernards voegden dertien NKI-onderzoekers en drie van het Amerikaanse biotechbedrijf Rosetta Inpharmatics (dochter van farmaciereus Merck) er in een half jaartje vijf nieuwe aan toe.

``Adembenemend'', noemt Britse genoomonderzoeker dr. Andrew Fraser in een bijbehorend commentaar in Nature ``de mogelijkheid om de genfuncties van een derde van het menselijk genoom zo snel te testen. En met de aanvullende tests onderbouwen de onderzoekers de kwaliteit van hun aanpak.'' Fraser houdt zich op de Wellcome Trust Genome Campus, 15 km ten zuiden van Cambridge, vooral bezig met de genen van wormen, gist en bacteriën.

De Nederlandse onderzoekers hebben hun collectie siRNA's de `NKi-RNAi-bibliotheek' gedoopt. RNA is bekend als het boodschappermolecuul (mRNA) dat de genetische informatie van het DNA overbrengt naar de plaats in de cel waar op basis van die genetische informatie eiwitten worden opgebouwd. De genetische informatie ligt vast door de volgorde waarin vier basen (aangeduid met de letters A, T (in RNA is het U), C en G) in lange moleculen aan elkaar zijn gekoppeld. Een mRNA is al snel honderden of zelfs duizenden basen lang.

De korte siRNA-moleculen die de basis vormen voor de bibliotheek zijn 19 basenparen lang. Ze verhinderen in alle diersoorten de synthese van eiwitten door mRNA's, waarin dezelfde volgorde van 19 basenparen voorkomt, te binden en te vernietigen. Dat blokkeren van de eiwitsynthese door siRNA's heet RNA interferentie (RNAi). Het mechanisme is van levensbelang bij schimmels, planten en dieren. Het is in de evolutie goed geconserveerd. Maar biochemici kennen het mechanisme nog maar tien jaar. En nu is het hot.

Bijzonder hot zelfs. De RNAi-bibliotheken komen als geroepen. De basenvolgorde van alle 25.000 menselijke genen is nu een paar jaar bekend en ligt voor iedereen toegankelijk in internetdatabanken. Maar van zeker de helft van die genen is de functie nog onbekend. De knock-outmuis was tot nu de standaard manier om een genfunctie te achterhalen. Een gen verraadt zijn werking als het wordt uitgeschakeld en er een gebrek, ziekte of handicap ontstaat. Door in een muizenembryo één gen gericht uit te schakelen en te zien wat er in de opgroeiende knock-outmuizen mis gaat, is het raadsel van de onbekende genen oplosbaar. Het maken en onderzoeken van zo'n knock-outmuis duurt een jaar. En dan is de werking van een gen van de muis bekend. Veel muizengenen komen ook bij de mens voor. Maar de overlap is niet 100%. En genen die erg op elkaar lijken, kunnen toch een andere functie hebben bij mens of muis.

snelheidswinst

Met RNA-interferentie zijn genfuncties veel sneller te vinden dan met knock-outmuizen. Maar RNA-interferentie heeft als nadeel dat het niet in levende dieren, maar alleen in celkweken toepasbaar is. Voordeel is dat in die kweken menselijke cellen kunnen worden gebruikt. Voor het bestuderen van een uitgeschakeld gen in een heel organisme, blijft de knock-outmuis onontbeerlijk. Maar de snelheidswinst maakt de RNAi-bibliotheken bijzonder aantrekkelijk. Fraser verwacht dat de bibliotheken snel algemeen gebruikt zullen worden en schrijft in zijn commentaar in Nature: ``de beschikbaarheid van deze siRNA-bibliotheken is een grote stap vooruit, en versterkt de screeningsmogelijkheden van alle zoogdiercelonderzoekers. Met het onderbrengen van de gegevens in een openbare, centrale database zet het begrip van de genfuncties bij zoogdieren een reuzenstap vooruit.''

Maar de NKi-RNAi-bibliotheek is voorlopig niet voor iedereen beschikbaar. Bernards, verontschuldigend: ``Om zo'n bibliotheek te maken moest ik snel een forse investering in chemicaliën kunnen doen. Het gaat om bijna een miljoen euro. Onderzoekssubsidies zijn in Nederland zelden ruimer dan een bedrag voor een post-doc, een analist en wat chemicaliën. En `snel' geld is ook moeilijk. Als ik nu voor 1 april een project indien, kan ik op 1 januari starten, als de subsidie al wordt toegekend. Dat geeft je een achterstand tegenover Amerikaanse collega's. Ik moest dus kiezen: snel een financierend consortium vormen met buitenlandse geldbronnen, of niets doen en de eer van de eerste RNAi-bibliotheek aan de Amerikanen laten.''

Het werd een consortium. Bernards: ``Met als nadeel dat het resultaat `for members only' is. Dat is geen gebruik in de wetenschap, maar ik zag geen andere uitweg.''

De bibliotheek is gratis beschikbaar voor onderzoekers van organisaties die aan het financierend consortium deelnamen. De Britse kankerbestrijding (Cancer Research UK) droeg 400.000 euro bij. Bernards: ``Zonder dat ik een subsidie-aanvraag heb hoeven invullen.'' Britse onderzoekers bestelden inmiddels al 200 kopieën. Onderzoekers van de 15 Nederlandse onderzoeksgroepen van het Cancer Genomic Consortium en het Center for Biomedical Genetics in Amsterdam, Rotterdam, Leiden en Utrecht kunnen de bibliotheek ook krijgen. Verder is hij te koop. Enkele farmaceutische industrieën betaalden het NKI 100.000 euro voor de NKi-RNAi-bibliotheek. Bernards: ``We gebruiken die inkomsten om de bibliotheek verder uit te breiden naar alle menselijke genen.'' Een buitenlands biotechbedrijf wil niet alleen een kopie van de bibliotheek, maar trekt ook aan één van de golden boys uit de NKI-onderzoekgroep waar die is ontwikkeld.

Een miljoen euro is een ongekend hoog bedrag voor een onderzoeksproject in de Nederlandse moleculaire biologie. Het maken van een RNAi-bibliotheek is dan ook een voorbeeld van small big science. Big science, omdat op een mooie dag chemicaliënleverancier Sigma chemie een 25-tal dozen met tienduizenden, volgens nauwkeurig opgegeven specificaties bestelde RNAi-moleculen afleverde. Met een rekening van 800.000 euro. Het NKI was daarmee in één klap Sigma's grootste klant op het gebied van op maat gemaakte RNAi-fragmenten. Maar de wetenschap achter zo'n RNAi-bank is tegelijkertijd klein, omdat er geen 25 mensen, of een kamer vol met pipeteerrobotten voor aan het werk zijn geweest. ``Dat is wat mensen verwachten,'' zegt Bernards, ``maar een bescheiden pipeteermachientje deed het werk. En drie onderzoekers bedienden hem.'' Veel geld uitgeven om snel de benodigde chemicaliën te verkrijgen en dan met weinig mensen hard aan de slag. Dat kenmerkt de post-genoom-jaren in de moleculaire biologie.

De vijf gevonden tumor-suppressorgenen demonsteren mooi hoe tegenwoordig snel uit een selectie van 8.000 genen tot nu toe onbekende functies worden gevonden. Bernards: ``De 8.000 genen waar we mee gingen werken zijn niet zomaar willekeurig uit de 25.000 menselijke genen gekozen. We hebben vooraf zoveel mogelijk genen in de databanken geïdentificeerd die mogelijk iets met kanker te maken hebben. Dat zijn genen die coderen voor eiwitten die een rol spelen bij de celdeling, bij het aan elkaar hechten van cellen. En genen voor boodschappermoleculen hebben we meegenomen, zoals de kinases. We wilden alle kinases mee laten doen. Dat zijn eiwitten die binnen de cel signalen doorgeven. Bijvoorbeeld om te delen. Of om juist daarmee te stoppen. Van 300 genen weten we zeker dat ze voor kinases coderen. Er zijn er bijna 600 die het misschien zijn. Dat vermoeden bestaat op grond van forse overeenkomsten in genvolgorde met genen die zeker voor een kinase coderen. Dan zijn er nog een 900-tal mogelijke kinases, waarvan de genen een veel kleinere overeenkomst met de bekende kinases hebben.''

afknippen

``Eén van de vijf genen die we hebben gevonden is een hydrolase'', zegt Bernards. ``Wij hadden die er nooit in gestopt. Maar de hydrolasen zijn op verzoek van onze farmaceutische partner toegevoegd. Hydrolases zijn bij veel stofwisselingsprocessen betrokken. Ze knippen een chemische groep af, onder binding van water. Ze zijn makkelijk met kleine moleculen te blokkeren en dat vinden farmaceuten interessant voor de medicijnontwikkeling. Je hoeft natuurlijk maar een ogenschijnlijk onbelangrijk stapje in een synthesepad stil te leggen, en de hele zaak stopt.''

Voor het stilleggen van één gen bevat de NKi-RNAi-bibliotheek steeds drie siRNA's. De basenvolgorde van iedere siRNA is gelijk aan een uniek fragment van het gen dat straks moet worden stilgelegd. De volgorde is geput uit de computerdatabases waarin de basenvolgorden van alle menselijke genen zijn vastgelegd. Dat werk is gedaan door onderzoekers van Rosetta Inpharmatics die mede-auteur zijn van het Nature-artikel. De uiteindelijke synthese van de bepaalde siRNA-volgorden is uitbesteed aan chemicaliënleverancier Sigma.

haarspeldvorm

De geselecteerde 19 siRNA-volgorden moesten `verpakt' worden in een basenvolgorde die de vorm van een RNA-haarspeld krijgen. In die haarspeldvorm is een siRNA het actiefst in een zoogdiercel. Daartoe is de complementaire volgorde bepaald, en een haarspeldbocht van een negental basen. Met nog enkele eind- en beginbasen is steeds een construct van 59 basen gesynthetiseerd, die een haarspeldvorm kunnen aannemen. Het construct wordt in de eerder in het NKI ontwikkelde pSUPER-vector gebouwd. De pSUPERs komen in virussen terecht waarmee ze in contact worden gebracht. En die virussen infecteren de menselijke cellen van de celkweek. Eenmaal binnen slagen drie RNAi's er vrijwel altijd in om één gen stil te leggen.

Om het proces te versnellen ontwikkelden de onderzoekers een methode waarin de siRNA's die 96 genen kunnen stilleggen (de opbrengst van één standaard laboratoriumplaat met 96 kleine reactievaatjes) in het testsysteem kwamen (zie grafiek). Het al of niet stoppen van de celgroei bij 39°C toonde dan aan of één van de 96 beproefde genen door een rol speelde in de aanmaak van p53.

Bernards: ``Nadat we 40 van die experimenten hadden gedaan, dus met 40 keer 96 genen, hebben we ons Nature-manuscript ingestuurd. We hadden toen zes genen gevonden, waarmee het principe van de werking was aangetoond. Eén van de gevonden genen is het gen voor p53. Dat moest er natuurlijk wel uitrollen. Het was een test. De andere vijf waren nieuw. Inmiddels hebben we de 8.000 bijna allemaal gedaan en ons aantal gevonden kandidaat tumor-suppressorgenen staat nu op 13.''

Experimenten die de precieze functie van de gevonden genen in de p53-regulering moeten ophelderen zijn ook bezig binnen het NKI. Bernards: ``Van de genen die we nu hebben gevonden hebben we geen idee hoe ze de p53-stofwisseling stilleggen na hun knock down. We weten alleen dat ze de activiteit van p53 beïnvloeden.''

Op zijn kamer laat Bernards zijn powerpointpresentatie draaien waarin hij laat zien hoe zijn onderzoeksgroep de NKi-RNAi-bibliotheek heeft gebruikt om genen te vinden die de gevoeligheid voor taxol (een chemotherapeuticum bij borstkanker) beïnvloeden. Bernards: ``Wij vinden nu de genen die beslissend zijn voor de vraag of taxol wel of niet werkt. Zo'n test is bij nog veel meer chemotherapiemiddelen mogelijk. Chemotherapie werkt meestal maar bij een minderheid van de patiënten. Als je vantevoren kunt nagaan bij welke tumor de therapie aanslaat, voorkom je veel ongemak bij patiënten bij wie het toch niets doet. Die krijgen alleen de bijwerkingen.''

Een RNAi-databank test ook de werking van een medicijn, voordat het überhaupt bestaat. ``Daarom staat de farmaceutische industrie nu op de stoep van de onderzoekers die een RNAi-bibliotheek hebben gemaakt,'' legt Bernards uit. ``Moderne farmacie probeert met een medicijn een gen uit te schakelen. Dat kun je doen met RNAi, al voordat je je medicijn hebt gevonden. Je kunt dus nagaan of het de moeite waard is om met een medicijn een bepaalde stofwisselingsstap te blokkeren. Ook de bijwerkingen worden dan direct zichtbaar.''