Bij breuk geen deling

De cel herstelt DNA-schade ogenblikkelijk. Onder de microscoop zijn de moleculaire details van de herstelwerkzaamheden te volgen.

EEN BREUK in een chromosoom is levensbedreigend. Allereerst voor de cel waar het chromosoom in zit, want een cel met een ongerepareerde breuk dwingt zichzelf om te sterven, via het proces van de geprogrammeerde celdood (apoptose). In alle levende cellen circuleren enzymen die chromosoombreuken herstellen, en de meeste van de miljoenen chromosomen die dagelijks in een mens breken worden hersteld. Maar een verkeerd geheelde chromosoombreuk kan kanker veroorzaken, meestal leukemie. Eén chromosoombreuk kan dus de voortijdige dood van een heel organisme veroorzaken.

Zorgvuldige reparatie van gebroken chromosomen is dus van levensbelang. Reparatie-enzymen die gebroken chromosomen lijmen zijn dan ook al meer dan 2 miljard geleden in de evolutie ontstaan. Over de manier waarop cellen chromosoombreuken helen is de laatste jaren veel bekend geworden. Vorige week liet de groep van prof.dr. Roland Kanaar, verbonden aan de afdelingen genetica en radiotherapie van het Erasmus Medisch Centrum in Rotterdam, samen met moleculaire microscopisten van het Academisch Medisch Centrum in Amsterdam zien dat herstel van gebroken chromosomen ongeveer een uur duurt. De brokstukken worden naar elkaar toe gesleept, waarna herstelenzymen de schade repareren (Science, 2 jan).

Kanaar: ``Vergeleken met andere enzymatische processen die in seconden kunnen verlopen lijkt de dubbelstrengsreparatie een langdurig proces. Maar bekijk je het op het niveau van de celdeling, dan is een uur niet lang. Een celdeling duurt een dag. De cel moet er echt in slagen om losse stukken weer aan elkaar te zetten. Zolang de breuken niet zijn hersteld, staat de celdeling stil.''

brokstukkenDe Amsterdamse microscopisten Jacob Aten en Jan Stap bedachten de detectietechniek, waarbij een radioactief alfadeeltje (een heliumkern) door een celkern wordt geschoten, loodrecht op het vlak van de kijkrichting van de microscoop. Zo'n alfadeeltje laat een recht pad van brokstukken achter. De belangrijkste schade bij een chromosoombreuk is het in twee stukken uiteenvallen van het lange DNA-molecuul met erfelijke informatie dat deel uitmaakt van ieder chromosoom. Een DNA-breuk kan betekenen dat er een gen verloren gaat of dat de controle over een gen wegvalt. Dat laatste is de reden van het ontstaan van sommige kankers, waaronder leukemieën. De reparatie-enzymen richten zich allereerst op het aan elkaar lijmen van DNA-brokstukken.

Met fluorescerende eiwitten die specifiek aan de breukvlakken binden is het spoor van gebroken DNA onder de microscoop te herkennen. Na een kwartier beginnen de brokstukken te clusteren en na een uur zijn er nog een paar gebieden waar alle breuken zijn samengetrokken.

In ieder van de celkernen van de miljarden cellen waar de mens uit bestaat breekt dagelijks duizenden keren een DNA-streng. Een DNA-molecuul bestaat uit twee in elkaar gewonden strengen met complementaire erfelijke informatie. En meestal breekt maar één van beide strengen. Die schade is snel te herstellen. Bij een enkelstrengsbreuk heeft een reparatie-enzym altijd de complementaire streng als matrijs tot zijn beschikkking, om het DNA foutloos in dubbelstrengstoestand te herstellen.

Een dubbelstrengsbreuk is moeilijker te herstellen. Dubbelstrengsbreuken zijn wat zeldzamer. Ze treden vooral op tijdens een celdeling en bij bestraling tegen kanker. Bij iedere celdeling van een beenmergcel, waar witte en rode bloedcellen en bloedplaatjes uit ontstaan, breekt naar schatting 200 keer een DNA-dubbelstreng. In het menselijk beenmerg delen die beenmergcellen miljoenen keren per dag.

Vrijwel onmiddellijk na een dubbelstrengsbreuk verschijnen er bij het breukvlak eiwitten die de schade beperkt proberen te houden. Mre11, een bolvormig eiwitcomplex met twee lange armpjes, bindt met zijn bolle kant aan het DNA en plakt met zijn armen aan de tentakels van later arriverende Mre11's. In het netwerk dat zo ontstaat raken de beide losse DNA-uiteinden meestal verknoopt. Mre11 is de snelle pleister die verhindert dat de brokstukken uit elkaar drijven.

De eerste hulp bij DNA-breuken van Mre11 was ook een ontdekking van Kanaars groep (Molecular Cell, nov 2001). Kanaar is een-na-laatste auteur van die publicatie. Laatste auteur is zijn Amerikaanse echtgenote dr. Claire Wyman die ook in Rotterdam werkt en is gespecialiseerd in het zichtbaar maken van macromoleculen met de scanning force microscope.

Kanaar: ``De tientallen verschillende enzymen die bij de reparatie betrokken zijn zwerven steeds rond in de celkern, of zijn daar aan het DNA gebonden. Ze binden net iets beter aan het oppervlak van DNA-breuken dan aan andere moleculen. Daardoor ontstaat er na een breuk opeenhoping van de reparatie-eiwitten aan de gebroken uiteinden.''

Alle eencelligen met een celkern (eukaryoten) en alle meercellige dieren hebben reparatie-enzymen voor dubbelstrengsbreuken. Er bestaan twee verschillende mechanismen van dubbelstrengsreparatie: niet-homologe eindverbinding en homologe recombinatie.

translocatieBij niet-homologe eindverbinding lassen enzymen twee DNA-uiteinden die ze vinden domweg tegen elkaar, zonder te controleren of ze de goede brokken lijmen. In hun ijver kunnen die enzymen de verkeerde brokken aan elkaar zetten. Zo ontstaat een translocatie: een mengvorm van twee chromosomen. Enkele aangeboren afwijkingen en veel vormen van leukemie en andere tumoren ontstaan als gevolg van dat soort translocaties. ``Maar de meeste zijn onschuldig,'' zegt Kanaar. ``In `oude' lichaamscellen vind je honderden mutaties, soms ontstaan door verkeerd aan elkaar geplakte dubbelstrengsbreuken. Meestal geeft dat niets. Het is daarom geen goed idee om die lichaamscellen te klonen.''

Tijdens homologe recombinatie checken de reparatie-enzymen wel of ze bij elkaar horende uiteinden lijmen. Dat doen ze door in de cel het overeenkomstige chromosoom op te zoeken. Alle lichaamscellen (behalve de geslachtscellen) hebben een dubbel stel chromosomen, het ene chromosoom is afkomstig van de vader, het ander van de moeder. Bij de homologe recombinatie leggen de reparatie-enzymen de brokken langs het overeenkomstige gebied van het intacte chromosoom, om te controleren of alles past.

``Vergelijk het maar met het maken van een legpuzzel,'' zegt Kanaar. ``Meestal gebruik je het deksel van de doos als voorbeeld. Je vergelijkt de afbeelding op een puzzelstukje met het plaatje op de doos. Aan de hand daarvan leg de stukjes in elkaar. Dat is de homologe recombinatie. Heb je geen voorbeeld bij de hand, dan ga je gewoon proberen tot een stukje past. Desnoods dwing je de stukjes om te passen. Dat is de niet-homologe eindverbinding.''

Begin jaren negentig waren DNA-reparatie-onderzoekers ervan overtuigd dat lichaamscellen van zoogdieren hun DNA-dubbelstrengsbreuken alleen met niet-homologe eindverbinding repareren en dat eencelligen, zoals gisten, hun dubbele DNA-breuken met homologe mechanismen herstellen. ``Jeroen Essers toonde in onze onderzoeksgroep aan dat in zoogdiercellen ook homologe recombinatie plaatsvindt. Dat was ons eerste grote resultaat in Rotterdam,'' zegt Kanaar (Cell, 18 april 1997). Hij studeerde biochemie in Leiden, deed zijn promotiewerk gedeeltelijk in de VS, en kwam na een zevenjarige postdoc-carrière aan de universiteit van Californië in Berkeley in 1995 naar Rotterdam.

Veranderingen in DNA-volgorden zijn altijd het centrale thema in Kanaars onderzoek geweest. Organismen proberen veranderingen, waarbij mutaties ontstaan, zoveel mogelijk te voorkomen, want ze kunnen de celhuishouding ontregelen en ziekten veroorzaken. Maar er zijn twee belangrijke uitzonderingen: de cross over en de vorming van het afweersysteem. Daarbij zijn dezelfde enzymsystemen actief die ook de DNA-reparatie verzorgen.

gekniptBij de vorming van geslachtscellen worden – tijdens de cross over – de genomen van de vader en de moeder die tot dan toe vrijwel ongewijzigd in nakomelingen aanwezig zijn, geknipt, gehusseld en weer geplakt. Het gevolg is dat de miljoenen zaadcellen en duizenden eicellen die mannen respectievelijk vrouwen produceren genetisch allemaal verschillend zijn. Tijdens dat proces ontstaan vele dubbele DNA-breuken. En die worden ook weer hersteld.

Bij de vorming van het afweersysteem, kort na de geboorte, is er opnieuw sprake van expres aangebrachte DNA-dubbelstrengsbreuken. Aan de genen voor de variabele delen van de antilichamen worden stukjes DNA toegevoegd of weggehaald, om het immuunsysteem zo goed mogelijk in te stellen op ziekteverwekkende indringers.

Kanaar: ``Het is duidelijk dat tijdens de cross over het homologe recombinatiemechanisme wordt gebruikt. Er moeten brokstukken worden verwisseld, maar bij het knippen en plakken mogen er geen fouten ontstaan. Bij de vorming van het afweersysteem is daarentegen van belang om zoveel mogelijk variatie te krijgen. Daar vind je dus niet-homologe eindverbinding. Zowel het afweersysteem als de geslachtelijke voortplanting zijn veel later in de evolutie ontstaan als de reparatiemechanismen. De reparatie-enzymen zijn dus op gegeven moment op een nieuwe manier gebruikt.''

filmpjeKanaars groep volgt de nieuwe aanpak in de biochemie: veel verschillende technieken gebruiken om de werking van individuele macromoleculen zichtbaar te maken. ``Uiteindelijk wil je een filmpje dat laat zien hoe een DNA-breuk wordt gerepareerd.'' Om dat te bereiken werkt Kanaar ook steeds vaker samen met natuurkundigen. ``Zij hebben de laatste jaren allerlei technieken ontwikkeld om één molecuul waar te nemen.'' Kanaar en Wyman hebben bijvoorbeeld al gezamenlijk gepubliceerd met de nanotechnolgiegroep van prof.dr. Cees Dekker van de TU Delft. De nanotechnologen bepaalden sterkte, flexibiliteit en andere eigenschappen van de kleverige armpjes van de eiwitten in het Mre11-complex (Proceedings of the National Academy of Sciences, 24 juni 2003). Kanaar: ``Met die technieken scoor je uiteindelijk alleen als je naar een biologisch belangrijk mechanisme kijkt. Die context bieden wij. Onze publicatie van vorige week accepteerde Science vooral omdat we ook inzicht verschaften in de medische consequenties van DNA-breuken.''