Poorten naar de cel

Deze week werd de Nobelprijs voor de Scheikunde 2003 uitgereikt aan de Amerikanen Peter Agre en Roderick MacKinnon. Ze identificeerden de water- en ionkanaaltjes van de cel en ontrafelden het werkingsmechanisme. Dit werpt licht op de oorzaak van tal van erfelijke ziekten, zoals taaislijmziekte.

`EEN VIJFTIG jaar oud raadsel is nu opgelost', schreef de Amerikaanse celbiofysicus Fred Sigworth op 1 mei van dit jaar in een News and Views in Nature. Begin jaren '50 ontdekten de Britse wetenschappers Alan Lloyd Hodgkin en Andrew Fielding Huxley dat zenuwcellen natrium en kalium in en uit laten stromen voor de productie van een zenuwimpuls in hun membraan (het omhulsel van de cel). Die ontdekking werd met de Nobelprijs (in 1963) beloond. Een halve eeuw later ontrafelde Roderick MacKinnon van de Rockefeller University (New York) het precieze moleculaire mechanisme achter de impulsgeleiding in zenuwcellen. In twee recente wetenschappelijke artikelen beschrijft hij voor het eerst de driedimensionale eiwitstructuur van een kaliumkanaaltje en ontvouwt hij een hypothese hoe dit kanaaltje snel kan openen in reactie op een elektrische prikkel.

``Sigworth was vol lof, maar kon niet vermoeden dat MacKinnon kort daarop de Nobelprijs zou krijgen voor zijn baanbrekende werk op het gebied van de ionkanalen'', zegt Carel van Os, hoogleraar celfysiologie in Nijmegen. ``Ik denk dat die prachtige Nature-publicaties van MacKinnon dit voorjaar bij het Nobelcomité de doorslag hebben gegeven. Peter Agre, die al langer hoog op de nominatielijst stond, is meegelift. Opvallend is dat beide onderzoekers nog zo jong zijn: MacKinnon is 47 jaar en Agre 54. Ze staan nog midden in hun onderzoekscarrière. Beiden hebben met cruciale ontdekkingen een heel nieuw onderzoeksveld ontsloten. Prachtig dat zij die Nobelprijs hebben gekregen.''

Van Os kreeg in 2001 het verzoek van het Nobelcomité een review te schrijven over het belang van het wetenschappelijk werk van zijn Amerikaanse collega Peter Agre, werkzaam aan de Johns Hopkins University (Baltimore). ``Ik kreeg zo'n dik pak aanbevelingsbrieven opgestuurd'', zegt Van Os terwijl hij met duim en wijsvinger de dikte van een telefoonboek aangeeft. ``Men wilde weten of Agre een nominatie voor de Nobelprijs waardig was.''

In de acht pagina's verslag die Van Os vervolgens produceerde, schrijft hij dat Peter Agre het complete onderzoeksveld versteld deed staan door zijn isolatie van het eerste waterkanaaltje in 1992, waarover hij publiceerde in Science. Agre isoleerde het eiwit CHIP28 uit rode bloedcellen en bewees een jaar later dat het eiwit functioneert als een moleculair watertransportkanaaltje. Hij deed dat door het CHIP28 in te bouwen in een eicel van de klauwpad Xenopus. Normaal zijn deze ondoordringbaar voor water, maar na toevoeging van CHIP28 drong het water met zo'n kracht naar binnen dat de eitjes opzwollen en binnen enkele minuten uiteen spatten. Later bedacht Agre de term aquaporine voor dit eiwit, sindsdien de gangbare naam voor waterkanaaltjes. Inmiddels zijn er bij de mens meer dan tien verschillende gevonden.

In de jaren tachtig, vóór Agres ontdekking, werd het bestaan van waterkanaaltjes door sommige biologen wel vermoed, maar er waren er ook die het onzin vonden. Van Os, met zijn groep een van de pioniers, probeerde het moleculaire mechanisme van watertransport in de nier te ontrafelen. ``Ik kon destijds geen student krijgen'', herinnert hij zich. ``En de Utrechtse aio die hier in Nijmegen promotieonderzoek aan waterkanalen kwam doen, oogstte verbijstering bij zijn voormalige begeleiders. De publicaties van Agre hebben alles veranderd. In één klap was de scepsis uit de wereld.''

Van Os was woensdag aanwezig bij de uitreiking in Stockholm. Een paar dagen voor zijn vertrek naar Zweden zit hij met collega-celfysiologen Peter Deen en Dick Ypey op zijn werkkamer die uitkijkt over het terrein van het Nijmeegse Radboudziekenhuis. De heren zijn blij dat het onderwerp waaraan zij alledrie onderzoek doen – en waarover het vanwege de complexiteit op een feestje lastig vertellen is – de erkenning heeft gekregen die het in hun ogen verdient. De fundamentele ontdekkingen die Agre en MacKinnon deden kunnen snel toepassingen krijgen, zo verwachten zij unaniem.

Water- en ionenkanaaltjes in de celmembraan zijn zo cruciaal voor het functioneren van de cel dat kleine veranderingen in de structuur ervan al gauw leiden tot ernstige aandoeningen. Heel wat erfelijke ziekten blijken terug te voeren op een storing in de kanaaltjes. Zo wordt de erfelijke ziekte cystische fibrose (taaislijmziekte) veroorzaakt door het ontbreken of slecht functioneren van een chloridekanaaltje. Doordat de cel geen chloride-ionen meer kan uitscheiden, ontstaat een cascade van gevolgen die ertoe leiden dat slijmvliezen, longen en geslachtsklieren `opdrogen'. Ypey legt uit: ``Als de cel geen chloride-ionen kan uitscheiden, kan hij ook geen natriumionen meer uitscheiden. Het komt er dus op neer dat de cel geen natriumchloride, keukenzout, meer kan uitscheiden, en zonder zout aan de buitenkant van de cel kan er ook geen water naar buiten stromen. Er wordt geen sap, geen slijm geproduceerd en dat heeft ten slotte verdroging en verbindweefseling van de slijmvliezen tot gevolg.''

Voorurine

Deen ontdekte in 1994 dat een enkele mutatie in het aquaporine-2 gen een erfelijke vorm van diabetes insipidus (gepaard gaand met veelvuldig urineren) veroorzaakt. Door de mutatie is in het waterkanaaltje op een cruciale plaats het aminozuur arginine vervangen door cysteïne. Daardoor kan het kanaaltje niet meer goed functioneren. Het gevolg is dat de nieren het water uit de voorurine niet goed resorberen, waardoor patiënten extreem veel moeten plassen en veel vocht verliezen.

Het Nijmeegse onderzoek concentreert zich nog steeds op aquaporine-2, maar nu op de remming ervan. Want te weinig aquaporine is slecht, maar te véél is ook niet goed. Deen: ``Dit kanaal is hetzelfde dat problemen veroorzaakt bij zwangerschapsoedeem, hartfalen en levercirrose. Daar proberen wij een specifiek geneesmiddel voor te vinden. We hebben inmiddels een stof gevonden die in vitro een aquaporine-2 kanaaltje kan blokkeren. Oei, ik moet nu oppassen met wat ik zeg. We zijn met een patentaanvraag bezig.''

Er zijn kapers op de kust, vult Van Os aan: ``Onze Amerikaanse collega Alan Verkman in San Francisco screent 5000 chemische stoffen per dag op hun blokkerende werking op aquaporines. Hij koopt bibliotheken van chemische stoffen die hij stuk voor stuk test, in de hoop dat er een goede bij zit. Wij zijn niet zo rijk, dus wij moeten het slimmer aanpakken. In Europees verband werken wij samen met chemici die voor ons de passende moleculen kunnen ontwerpen en synthetiseren.''

Nog steeds leggen onderzoekers nieuwe verbanden tussen bekende aandoeningen en slecht functionerende kanaaltjes. Van bijna alle bekende genen die iets met de kanaaltjes van doen hebben zijn door diverse onderzoekers al knock-outmuizen gemaakt, een methode om te zien wat er misgaat als zo'n onderdeel ontbreekt. Zo geeft een mutatie aan aquaporine-0 een vertroebeling van de ooglens omdat de zeer gespecialiseerde transparante lensfibercellen geen vocht meer kunnen uitscheiden. Een storing in aquaporine-5 leidt tot een tekort aan speeksel en traanvocht. Fouten in ionkanalen zijn in verband gebracht met uiteenlopende ziektes, zoals hartritmestoornissen, epilepsie, migraine en spierziekten.

``Een storing aan een kanaaltje hoeft echter niet direct tot problemen te leiden'', legt Deen uit. ``Sommige kanaaltjes lijken redundant. Alleen bij een bepaalde belasting kun je toch problemen krijgen. Zo zijn er mensen die aquaporine-1 missen, maar niettemin een vrij normaal leven leiden. Alleen als zij te weinig drinken gaat het fout. Er is een beroemd geval van tweelingbroers ergens in Duitsland die samen in de bouw werkten. Zij namen dagelijks een aanhangwagentje met drinkwater mee, maar verder functioneerden zij volkomen normaal.''

Uitwisseling

De celmembraan is door zijn vetachtige samenstelling nauwelijks doordringbaar voor water en daarin opgeloste ionen, de geladen deeltjes van zouten. Toch is het enorm belangrijk dat de cel water en zouten kan uitwisselen met zijn omgeving. Via kanaaltjes, poortjes of tunnels door de celmembraan kan die uitwisseling op een gereguleerde wijze plaatsvinden. Deze kanaaltjes zijn vaak heel erg selectief en laten slechts één of enkele soorten moleculen passeren. Ionenkanaaltjes laten selectief ionen door, zoals natrium, kalium, calcium, of chloor. Waterkanaaltjes laten alleen watermoleculen of bepaalde kleine waterachtige moleculen als glycerol door.

Ion- en waterkanaaltjes zijn cruciaal voor het leven en komen dan ook in alle levende organismen voor, van bacteriën tot aan de mens. In de loop van de evolutie van eencellige naar complexe organismen is er weinig aan het ontwerp van de kanaaltjes veranderd. Ypey: ``De ionkanaaltjes in bacteriën verschillen nauwelijks van degene in onze hersenen die het mogelijk maken om na te denken.'' Dat maakt het onderzoek aan de kanaaltjes stukken eenvoudiger omdat een simpel te kweken bacterie als model even goed voldoet als de menselijke cel.

Het aantal soorten kanaaltjes is overzichtelijk. In het recent opgehelderde complete genoom van het wormpje Caenorhabditis elegans werden acht genen aangetroffen voor natrium- en calciumkanalen en zo'n tachtig voor kaliumkanalen. Omdat vier van deze eiwitten samen een kanaaltje vormen, kunnen uiteenlopende combinaties van deze eiwitten kanaaltjes met verschillende eigenschappen vormen.

De eiwitten van waterkanaaltjes komen nooit in verschillende combinaties voor, waardoor de diversiteit beperkt is. In de mens zijn tot nu toe elf of twaalf verschillende waterkanaaltjes gevonden. Planten bezitten wel meer dan 250 verschillende aquaporines, en daaruit blijkt wel dat de waterhuishouding voor hen heel erg belangrijk is. Maar toch berust dit mechanisme in mens en plant op hetzelfde principe. Van Os: ``De plant lijkt wat dat betreft sterk op de menselijke nier. Alleen: de betreffende onderzoekers weten dat niet van elkaar. Duitse celbiologen publiceerden een paar jaar geleden onderzoek waarin zij bij een plant, Arabidopsis, een mutatie hadden aangebracht in een aquaporine. Daardoor kregen de wortels een lage waterpermeabiliteit. De plant compenseert dat door een geweldige wortelboom aan te leggen. Het grappige is nu dat een soortgelijke aquaporine essententieel is voor de functie van de menselijke nier.''

Aquaporines komen altijd voor als tetrameren: vier gelijke eenheden die samen een cluster van vier waterkanaaltjes vormen. ``Het lijkt net een douchekop'', zegt Van Os. ``De watermoleculen spuiten er in vier stralen tegelijk doorheen.''

De ionkanaaltjes in het celmembraan hebben daarentegen maar één gaatje, gevormd door langgerekte eiwitketens die tot een compacte kluwen zijn opgevouwen. De porie is door zijn ruimtelijke vorm en elektrostatische wisselwerking heel selectief voor het soort ionen dat het doorlaat. Zo laat een kaliumkanaaltje kaliumionen passeren, maar de veel kleinere natriumionen niet. In een computermodel van de atomaire structuur van het kanaaltje blijkt waarom: het natriumion is te klein om de juiste elektrostatische bindingen met de binnenkant van het kanaaltje aan te gaan. Daardoor kan het niet uit de oplossing treden, terwijl het kalium daartoe wel verleid kan worden.

Het zogeheten selectiefilter in het kaliumkanaaltje bestaat volgens MacKinnon uit een opeenvolgende reeks van K+-bindingsplaatsen, die bijna exact de waterige omgeving simuleren. Zo kan een ion dat is opgelost in water vrijwel moeiteloos het kanaaltje binnengaan. In het selectiefilter van een kaliumkanaaltje zijn vier driedimensionale bindingsplaatsen voor kaliumionen. Omdat de ionen elkaar vanwege hun positieve lading afstoten, zit er echter altijd een lege plaats tussen de ionen in het filter. Er zitten dus maximaal twee kaliumionen tegelijk in het filter. Door telkens een plaatsje op te schuiven, komt de stroom op gang.

Membraanpompen

Kanaaltjes verbruiken geen energie bij het doorlaten van moleculen, hun werking berust op het concentratieverschil tussen het binnen- en buitenmilieu van de cel. Daarin verschillen ze dus van de zogeheten membraanpompen, grote eiwitten in de celmembraan die actief moleculen transporteren.

Ionkanaaltjes kunnen in tegenstelling tot waterkanaaltjes, openen en sluiten. Sommige reageren op bepaalde stoffen, anderen op mechanische prikkels of op spanningsverschillen tussen binnen- en buitenkant van de cel. Zo kan de cel nauwkeurig bepalen welke ionenconcentratie in het binnenmilieu wordt gehandhaafd. De cel regelt het watertransport op een andere manier, eenvoudig door meer of minder aquaporines in de membraan aan te brengen.

Net als ionkanaaltjes zijn ook waterkanaaltjes kieskeurig. Ze hebben in doorsnede de vorm van een zandloper: twee trechters die omgekeerd op elkaar aansluiten met halverwege een vernauwing die de selectiviteit waarborgt. Binnenin het waterkanaaltje klapt het lokale elektrostatische veld plotseling om. Dit heeft enerzijds tot gevolg dat watermoleculen tijdens het transport gedwongen worden een halve slag te draaien, en anderzijds vormt dit elektrostatische veld een dusdanig hoge barrière dat geladen deeltjes (ionen, opgeloste zouten) niet door het kanaaltje worden doorgelaten. Dit is met name cruciaal voor protonen (waterstofionen) omdat het `lekken' van deze deeltjes door de waterkanaaltjes een verstoring van de energievoorziening van de cel zou betekenen.

In 1998 bepaalden MacKinnon en zijn medewerkers als eersten de ruimtelijke structuur van een kaliumkanaaltje. Dat deden zij met behulp van röntgenkristallografie. Die techniek vereist dat een eiwit in kristalvorm beschikbaar is, omdat pas in het regelmatige kristalrooster de juiste interferentie van röntgenlicht ontstaat waaruit de positie van de atomen is af te leiden. Kristallisatie van eiwitten die in een celmembraan zitten, is erg lastig en daarom kostte het MacKinnon jaren voor hij slaagde.

Voor het eerst bestaat er nu een nauwkeurig beeld hoe ion- en waterkanaaltjes werken. Uit de DNA-volgorde van de bijbehorende genen kon men al langer de volgorde van de aminozuren in het eiwit herleiden, maar met alleen die lineaire volgorde blijkt het in de praktijk lastig te voorspellen hoe een eiwit zich precies opvouwt tot een driedimensionale structuur. Juist die ruimtelijke structuur bepaalt het gedrag van het molecuul, en daarmee de functie in de cel.

Volgens Van Os heeft het nu bekroonde werk een enorme impact. ``Het is anatomie op atoomniveau. Met deze kennis kunnen we aan moleculaire pathologie doen. De farmaceutische industrie verdient op dit moment zijn geld in hoofdzaak aan membraaneiwitten, meestal receptoren die zich aan de buitenkant van de cel bevinden. Nu komen daar de kanaaltjes bij. Tot vijf jaar geleden was dit een black box, maar de grote vorderingen die de moleculaire biologie heeft gemaakt hebben dat radicaal veranderd.''

Animaties van de waterstroom door een aquaporine, gemaakt door de Nederlandse onderzoeker Bert de Groot en zijn collega's zijn te zien op: http://www.mpibpc.gwdg.de/abteilungen/073/gallery.html