Precies pas

Stikstofbindende bacteriën zijn helpers van vlinderbloemige planten. Het herkennen van de juiste bacterie hoort tot de meest specifieke reacties in de plantenwereld. Wageningse moleculair biologen ontrafelden het mechanisme.

Vrijdag hadden ze champagne in het lab. De Wageningse onderzoeksgroep van moleculair bioloog prof.dr. Ton Bisseling zag tien jaar wetenschappelijk speurwerk beloond met een publicatie in Science. René Geurts en Rik Limpens ontrafelden het intrigerende samenspel tussen vlinderbloemige planten en de stikstofbindende Rhizobium-bacteriën die in hun wortelknolletjes leven. Uit een rupsklaverplant kloneerden ze de receptor waarmee de plant de juiste stikstofbindende bacteriën herkent. Deze week verschijnt het artikel op internet, de gedrukte versie volgt een paar weken later. ``Ineens merkte ik dat onze Deense collega's ons op de hielen zaten'', zegt Ton Bisseling, hoofd van het Laboratorium voor Moleculaire Biologie in Wageningen. ``Een maand geleden hoorde ik toevallig op een congres in Sint Petersburg dat zij straks met een verhaal in Nature komen. Toen hebben we dit binnen een week op papier gezet en hals over kop naar Science gestuurd.''

Vlinderbloemige planten zijn bijvoorbeeld bonen en erwten, klaver en soja. Zij zorgen voor hun eigen stikstofbemesting dankzij ondergrondse wortelknolletjes. In de knolletjes leven Rhizobium-bacteriën, die stikstof uit de lucht binden en omzetten in ammonium als voedselbron voor de plant. In ruil daarvoor levert de plant de nodige koolstofbronnen aan de bacteriën. Dit samenleven tot wederzijds voordeel noemen biologen een symbiose. ``Je kunt het vergelijken met de paddestoelen uit het bos, de mycorrhiza-schimmels die met boomwortels samenleven'', zegt Bisseling.

Traditioneel spelen vlinderbloemigen een sleutelrol in duurzame landbouwsystemen. Zuid-Amerikaanse boeren zaaien maïs naast bonen, in het Midden-Oosten zie je afwisselend linzen en graan. De Romeinen wisten al dat je op een nieuw bonenveld grond uit het oude veld moest strooien om de planten beter te laten groeien. Daarmee worden Rhizobium-bacteriën naar het nieuwe veld gebracht. De plant reageert daarop met de vorming van wortelknolletjes, waarin de bacteriën zich nestelen.

In het laboratorium is het proces schitterend te volgen. ``Kijk'', wijst Bisseling, ``we hebben de bacteriën voor deze gelegenheid uitgerust met een fluorescerende kleur, waardoor ze onder de microscoop groen oplichten. Hier zie je hoe ze de wortelhaar naderen, aangetrokken door de geur van hun lievelingsplant.'' Al na een uur begint de plant een klein wortelknolletje te vormen. De turgor (druk) die op een wortelhaar staat is een paar maal hoger dan de druk in een autoband. ``Als de bacterie de wortelhaar zomaar aanprikt, loopt die leeg'', legt Bisseling uit. ``In plaats daarvan zet de bacterie de plant er toe aan om zijn wortelhaar te laten omkrullen, zodat een holletje ontstaat, omgeven door de celwand en plasmamembraan van de plant. Hierin vormen de bacteriën een van de buitenwereld afgesloten microkolonie. Vervolgens vormt de plant een buis waardoor de bacterie verder naar binnen groeit in de richting van de basis van de wortelhaar.''

klakkeloos

Het herkenningsproces luistert heel nauw, want rondom de plantenwortels miegelt het van de micro-organismen. ``Een plant die klakkeloos allerlei ziekteverwekkers in zijn wortels laat binnendringen gaat te gronde'', zegt Bisseling. ``En zelfs van de nuttige bacteriën moet een bonen- of erwtenplant er liefst niet te veel toelaten, want het maken van wortelknolletjes en het leveren van koolhydraten kost de `gastheer' veel energie en zijn eigen stikstofbehoefte is niet onuitputtelijk.''

De bacterie gebruikt een `sleutel', die alleen bij de juiste plant in het `slot' past. Als startsein van het infectieproces scheidt de Rhizobium-bacterie een molecuul uit, de zogenoemde Nod-factor, die door de plant wordt herkend. ``Met die sleutel wordt het proces opgestart'', zegt Bisseling. ``In gezuiverde vorm roept dit molecuul al in minieme hoeveelheden, nano- of picomolair precies dezelfde reactie bij de plant op als de Rhizobium-bacterie zelf. Binnen een dag zie je de eerste prille wortelknolletjes ontstaan.''

De Nod-factor bestaat uit een `ruggengraat' van vier of vijf eenheden chitine met daaraan een vetzuur. Daaraan gekoppeld zit nog een paar decoraties die het molecuul specifiek maken. De Nod-factor van de Rhizobium-bacterie die samenleeft met sojaplanten ziet er net iets anders uit dan die van de Rhizobium-bacterie in de luzerneplant. Waar de één een waterstofatoom heeft, bezit de ander bijvoorbeeld een sulfaatgroep.

Volgens Bisseling is de waardplantreactie heel specifiek. Een erwtenplant uit Afghanistan reageert niet op een Nederlandse Rhizobium-bacterie en omgekeerd. Dan zit er blijkbaar net een verkeerd tandje aan de sleutel, zoals een extra acetaatgroep. Dat bleek uit proeven met de uitgebreide collectie erwten die de Wageningse microbioloog Lie verzamelde in het Midden-Oosten en Afghanistan. Vaak `klikte' het niet tussen bacterie en plant. De plant begon dan wel een wortelknolletje te maken en zijn wortelharen krulden op, maar vervolgens slaagde de bacterie er niet in de plant een infectiekanaal te laten maken.

Bisseling: ``De vorming van wortelknolletjes is één van de meest specifieke waardplantreacties in het plantenrijk. Dat deed ons vermoeden dat er een plantenreceptor in het spel moest zijn, een slot waarop de sleutel past. De plant moet het infectieproces namelijk zelf goed kunnen controleren om ongewenste indringers te weren. Dat is van vitaal belang.''

kandidaat-genen

Bij nader inzien zijn erwten geen ideale proefplant om genen uit te klonen. Ze hebben namelijk een heel groot genoom, vergelijkbaar met dat van de mens, met onhandig veel repeterend DNA. Daarom stapten de onderzoekers over naar de rupsklaver (Medicago). Zijn genoom is tienmaal zo klein. Uit 15 kandidaat-genen kon Bisselings groep na lang experimenteren de juiste twee aanwijzen dankzij een recent ontdekte en nu al veel toegepaste techniek, de omgekeerde genetica (reverse genetics). Deze subtiele werkwijze komt er op neer dat men een reeks RNA-constructen maakt en in de wortelcellen inbrengt om telkens één specifiek gen uit te schakelen en dan te kijken wat er misgaat in de cel. Daaruit valt terug te redeneren hoe het normale gen blijkbaar functioneert. Zo kwam Bisseling uiteindelijk twee zeer veel op elkaar gelijkende genen op het spoor die betrokken zijn bij het infectiekanaal in de wortelhaar. Als deze genen worden uitgeschakeld, wordt de bacterie-infectie geblokkeerd en loopt het hele proces spaak. Zo slaagden de Wageningers er als eersten in om de plantenreceptor te kloneren als `slot' waarop de `sleutel' van de bacterie past.

Bisseling: ``Het begint nu heel fascinerend te worden. Eind dit jaar zullen alle relevante genen in dit proces door diverse onderzoeksgroepen gekloneerd zijn. Daarmee krijgen we fantastische nieuwe hulpmiddelen voor plantenveredeling in handen. We gaan een heel nieuwe fase in.''

Op het International Rice Research Institute (IRRI) op de Filippijnen wordt eveneens veel onderzoek gedaan naar biologische stikstofbinding. Uiteindelijk hoopt men de rijstplant (van nature geen vlinderbloemige) genetisch zo te manipuleren dat hij zelfvoorzienend wordt voor zijn stikstofbemesting. Bisseling: ``Het zal niet makkelijk zijn, maar uiteindelijk moet het kunnen. Genetisch gezien is het niet zo ingewikkeld als we vroeger dachten.''