Verschoven spierziekte

Leidse genetici proberen patiënten met Duchenne- spierdystrofie te ver- anderen in mensen met Becker-spierdystrofie, een mildere vorm.

`Met een milde Becker-spierdystrofie heb je een bijna normale levensverwachting. En de ziekte verloopt langzamer. Duchennepatiënten zitten voor hun twaalfde in een rolstoel en worden zelden ouder dan 30. Maar sommige Beckerpatiënten lopen tot hun zestigste', zegt dr. Judith van Deutekom, universitair docent op het laboratorium van humane genetica van de Universiteit Leiden.

Dit weekend wordt in Rotterdam een internationaal wetenschappelijk congres gewijd aan neuromusculair onderzoek. Van Deutekom zal er vertellen over het Leidse onderzoek naar exon skipping bij Duchenne-spierdystrofie: het selectief uitschakelen van coderende delen van een gen (de exonen). Slaagt zo'n exon-uitschakeling, dan verandert een Duchennepatiënt die een kort leven in een rolstoel wacht in een Beckerpatiënt met mildere ziekte. De techniek werkt in geïsoleerde spiercellen van patiënten. Experimenten met mensen zijn pas mogelijk als de muizenproeven die gaande zijn succesvol zijn verlopen.

Exon skipping is een gouden greep bij Duchenne spierdystrofie. Daar zijn een paar redenen voor: het Duchenne-gen bevat de erfelijke code voor het spiereiwit dystrofine en daarvan kan de mens een flink deel missen, als de kop en staart van het eiwit er maar zijn. Duchennepatiënten missen die staart en zijn snel ernstig gehandicapt; bij Beckerpatiënten ontbreekt alleen een middendeel van het eiwit. Een andere reden voor het succes van exon skipping is dat het eiwit zo veel exonen heeft. Het Duchenne-gen is het langste menselijke gen. Het DNA-molecuul waar het gen uit bestaat telt maar liefst 2,4 miljoen basenparen die de erfelijke code bepalen. Slechts een fractie van die 2,4 miljoen basenparen is nodig om de aminozuurvolgorde in het (toch ook weer grote) spiereiwit dystrofine vast te leggen. En de 14.000 basenparen die echt voor eiwit coderen liggen in 79 brokstukken (exonen) in het gen verdeeld. Tussen die exonen liggen de intronen, de niet voor eiwit coderende DNA-volgorden.

Waarom dat gen zoveel ogenschijnlijk nutteloos DNA bevat is onbekend. ``Het lange gen verhoogt wel het risico op breuk en fouten'', zegt Van Deutekom. Eén op de 3.500 jongens komt met de aandoening ter wereld.

fatale fout

Het Duchenne-gen ligt op het X-chromosoom, waarvan vrouwen er twee hebben en mannen één. Vrouwen met een X-chromosoom waarop een Duchenne-gen met een fatale fout ligt, zijn bijna altijd tegen ziekte beschermd doordat ze nog een X-chromosoom met goed werkend Duchenne-gen hebben. Maar als zij van een jongetje bevallen heeft dat 50% kans op de ziekte. Het Duchenne-gen bevat de erfelijke code voor het eiwit dystrofine. Dat is een lang molecuul dat met zijn staart in het celmembraan van de spiercel vastzit en met zijn kop aan het spiereiwit actine is gebonden. Het verankert de samentrekkende eiwitten aan de cel.

Van Deutekom heeft het principe van exon skipping bij Duchenne gedemonstreerd met de spiercellen van twee patiënten die beiden een stuk van het gen met exon 45 missen. Het ontbreken van exon 45 heeft dramatische gevolgen, want vanaf exon 46 loopt de eiwitsynthese helemaal mis. Dat komt doordat iedere drie opeenvolgende basen (een codon) in een gen coderen voor één aminozuur in het eiwit waarvoor het gen codeert, maar een exon bevat bijna nooit gehele codons. Een intron ligt vaak domweg middenin een codon. Bij de patiënten volgt exon 46 direct op exon 44 en daarbij worden twee onvolledige codons van maar één base aan elkaar gekoppeld. Er ontbreekt dus één base en daardoor verspringt stroomafwaarts van de deletie het aflezen van de drietallen één positie. Dat heet de frame shift. Voor de oppervlakkige toeschouwer is de code nog hetzelfde, maar door de verschuiving van één positie leest de eiwitsynthesemachine opeens een heel andere code. Na de deletie verschijnen er in het eiwit dus aminozuren die er niet horen te zijn, wat een niet-werkend eiwit oplevert.

stopcodon

Bij deze Duchenne-patiënten loopt de eiwitsynthesemachine in exon 46 ook nog eens tegen een stopcodon op. De eiwitsynthese stopt abrupt en daardoor ontbreekt de eiwitstaart. Van Deutekom: ``Bij gentherapie probeert men al tien jaar de genetische code van buiten af in alle spiercellen te brengen. Dat lukt nog niet omdat het virus dat het gen binnen de cel moet brengen dat lange gen niet kan bevatten. Er is nu wel een adenovirus waar het gen in past, maar dat is er niet echt een meester in om spiercellen binnen te dringen (zie bijlage W&O, 21 sept). Waarom zou je niet gebruik maken van het gen dat – met een paar foutjes – al in de patiënten aanwezig is?'' Gencorrectie ligt bij Duchenne misschien wel meer voor de hand dan gen-additie.

Exon skippers zoals Van Deutekom willen niet alleen het stopcodon vermijden, maar natuurlijk ook de frame shift herstellen, zodat er stroomafwaarts van de deletie geen nonsense-eiwit ontstaat. Van Deutekom: ``We weten precies waar de exonen beginnen en eindigen. Als exon 44, het laatste gezonde exon, bijvoorbeeld eindigt na de eerste base van een triplet dat voor een aminozuur codeert, moet je het eerstvolgende exon zoeken dat begint met de tweede base van een coderend triplet. Schakel je de tussenliggende exonen uit, dan mis je een stukje, maar je weet zeker dat de staart van het eiwit weer in orde is.''

In het voorbeeldexperiment (Human Molecular Genetics (2001) 10, 1547-1554) sloten de Leidse genetici het eind van exon 44 en het begin van 47 op elkaar aan waardoor het reading frame was hersteld. ``Bovendien'', zegt Van Deutekom, ``was uit onze database van genafwijkingen bij Beckerpatiënten bekend dat patiënten die exon 45 en 46 missen, een mildere vorm van de ziekte hebben.''

Exon skipping gebeurt tijdens de aanmaak van messenger-RNA. Messenger- of boodschapper-RNA (mRNA) brengt de erfelijke code van de celkern, waar de chromosomen liggen, naar de ribosomen, waar op basis van de mRNA-matrijs de eiwitproductie plaatsvindt. Wanneer een eiwit nodig is, gaat er een signaal naar de celkern, waar op een chromosoom het stuk DNA wordt opgezocht met het gen voor dat eiwit. Dat stuk DNA wordt ontrold, tijdelijk overlangs gesplitst, waarna er een kopie in RNA van het DNA wordt gemaakt. Dat is het pre-mRNA. Bij het Duchenne-gen is dat dus 2,4 miljoen basen lang. Knip- en plakenzymen gaan vervolgens de intronen verwijderen. Ze binden zich aan het pre-mRNA, vouwen de keten zo dat het eind van het ene exon vlakbij het begin van het volgende exon ligt, knippen dan de intronen eruit en zetten de exonen op de juiste manier tegen elkaar. RNA-splicing heet dat. Van Deutekom: ``De mRNA-keten is enkelstrengs. Je kunt dus een klein stukje RNA van ongeveer 15 basen lang maken dat precies complementair is aan een gewenste volgorde. Dat bindt er dan stevig aan vast en blokkeert de splicing op een bepaalde plaats.'' Zo ontstond een mRNA waaraan exon 45 en 46 ontbreken.

Nadat de werking in muizencellen en in de geïsoleerde spiercellen van de patiënten vorig jaar was bewezen (in 50 tot 80% van de cellen verschijnt een maand lang weer werkzaam dystrofine), ontwikkelde en testte Van Deutekom nog veel andere RNA-probes waarmee vijftien andere exonen kunnen worden geskipt. Dat is voldoende om meer dan driekwart van de bekende mutaties bij Duchennepatiënten te veranderen in `Beckermutaties'. De gencorrectie-experimenten bij levende muizen met Duchennedystrofie zijn al een tijdje bezig en lukken in één spier. Die dieren krijgen het corrigerende antisense-RNA-fragment namelijk nog geïnjecteerd in een `proefspier'. Van Deutekom: ``Het onderzoek spitst zich toe op de toedieningsvorm. Met injecties red je het nooit. Je zou eens in de paar maanden duizenden injecties in alle spieren moeten geven. Het moet uiteindelijk maar dan zijn we een aantal jaren verder een pil worden. We zijn bezig met de ontwikkeling van peptiden die het antisense-RNA heel gericht in spiercellen afleveren.''