Niet kapot te krijgen

Dankzij zijn sporenvorming is de Bacillus anthracis bestand tegen vele gevaren en na jaren nog zeer kiemkrachtig. Ideaal als wapen.

Miltvuur of antrax is een typische veeziekte waarvoor herkauwers (runderen, geiten, schapen) en paarden gevoelig zijn. Onder normale omstandigheden raken mensen maar zelden besmet met de verwekker van de ziekte, de bacterie Bacillus anthracis. Risicogroepen bestaan uit personen die huiden, wol of beenderen verwerken en jagers die zelf hun jachtbuit villen. Sporadisch raken nog mensen besmet als zij vlees eten van een dier dat aan miltvuur leed.

Op tal van plaatsen op aarde komt de veeziekte nog algemeen voor. De `World Anthrax Data Site' toont vooral het Midden-Oosten en de Sahel als ziektehaarden. Maar er zijn veel andere gebieden waar de ziekte zich handhaaft omdat karkassen niet snel en veilig worden afgevoerd. In Nederland is miltvuur al in de jaren dertig door een strakke kadaverdiscipline uitgeroeid. Getroffen vee werd in diepe kuilen begraven en afgedekt met ongebluste kalk. De `witte kuilen' werden gemarkeerd met bomen of struiken.

Besmette vacht

Dieren raken met miltvuur geïnfecteerd door het eten van gras waarop antrax-sporen aanwezig zijn of door te likken aan de besmette vacht. Ook zouden bijtende insecten de sporen kunnen overdragen. In het laatste geval ontwikkelt zich huid-antrax, in de andere gevallen darm-antrax, die een ongunstiger verloop heeft. Als de infectie aanslaat treedt in het lichaam, vooral in het bloed, een reusachtige vermeerdering van de bacterie op. Sterft de gastheer en wordt het karkas aangevreten dan gaan de antrax-bacteriën op plaatsen waar lucht toetreedt en het weefsel uitdroogt over tot sporenvorming. Sporen zijn verstevigde, inactieve cellen die goed overleven. Rond een aangevreten karkas is het terrein meestal zwaar met sporen besmet. In een intact karkas dat langzaam wegrot worden de antrax-bacteriën door rottingsbacteriën verdrongen.

Het natuurlijk `reservoir' van de miltvuurbacterie is dus de bovenste bodemlaag. De bacterie vermeerdert zich niet in de bodem, maar de sporen blijven uiterst lang kiemkrachtig en zijn goed bestand tegen de inwerking van warmte, droogte en zonlicht. Alleen langdurige inwerking van ultraviolette straling tast de overlevingskans aan. Het Schotse eilandje Gruinard waar de Engelsen in 1941 experimenteerden met miltvuur-munitie bleef infectueus totdat het tenslotte in de jaren tachtig werd ontsmet met formaline.

Virulente antrax-stammen isoleert men makkelijk uit bloedmonsters van aan miltvuur bezweken dieren. In gebieden waar veel miltvuur voorkomt is de bacterie ook uit grondmonsters op te hopen. Erkende onderzoekers plaatsen gewoon een bestelling bij een van de honderden instituten die referentie-stammen in beheer hebben.

De uit karkassen of bodemmonsters verzamelde miltvuurbacteriën zijn eenvoudig te zuiveren van begeleidende bacteriën en verder door te kweken. Voor kleine cultures gebruikt men afgedekte schaaltjes met een zogenoemde `vaste voedingsbodem', bestaande uit schapenbloed waaraan agar-agar (een verdikkingsmiddel) is toegevoegd. Op dit medium komt de bacterie na verloop van tijd spontaan tot sporenvorming.

Nutrient broth

Voor de bereiding van grotere hoeveelheden antrax gebruikt men vloeibare voedingsoplossingen in glazen kolven (`erlenmeyers') of roestvrijstalen vaten. De voeding bestaat uit een heel gangbaar, rijk medium, zogenoemde `nutrient broth', waaraan hoogstens wat mineralen zijn toegevoegd. Er wordt doorgaans gekweekt bij neutrale zuurgraad, een temperatuur van 37 graden en krachtige beluchting. Groeien dit soort cultures dicht dan treedt ook hier vaak spontaan sporenvorming op. De internet-literatuur beschrijft voedingsoplossingen (zoals die van Leighton en Doi) waarin Bacillus-soorten extra makkelijk sporen vormen. Na het kweken `oogst' men de bacteriën door de oplossingen te filtreren of te centrifugeren. Het gevreesde witte poeder is mogelijk het gedroogde en fijngewreven resultaat van zo'n oogst. Als gevriesdroogde preparaten zijn ze bij kamertemperatuur in het donker nagenoeg onbeperkt houdbaar. Voor professionele opslag worden de bacteriën opgenomen in glycerol en bewaard bij min tachtig graden.

De bacterie Bacillus anthracis werd al in 1876 door Robert Koch aangewezen als verwekker van miltvuur en volgens de regels rein gekweekt. Louis Pasteur bereidde een paar jaar later het eerste vaccin en al binnen enige decennia zijn de verworven inzichten misbruikt voor oorlogsdoeleinden: Duitse troepen probeerden in de Eerste Wereldoorlog paarden van de vijand te infecteren. Tijdens de Tweede Wereldoorlog is antrax op grote schaal in productie genomen in Japan, Engeland, Canada, de VS en Rusland. Al deze programma's zijn inmiddels beëindigd. In 1995 bleek dat ook Irak en de Japanse sekte Aum Shinrikyo antrax kweekten. Aangenomen wordt dat ruim 15 andere landen (zoals Noord-Korea, Iran, India, Syrië) inmiddels ervaring hebben met antrax-productie. Antrax geldt als een zeer geschikte bacterie voor biologische wapens, omdat het gemakkelijk is te kweken. Verder is het zeer virulent en gemakkelijk te bewaren – pestbacteriën lopen heel snel in kwaliteit terug.

Sinds 1995 worden Amerikanen vrijwel permanent bedreigd met antrax-brieven maar tot aan oktober is nooit werkelijk antrax verstuurd. Toch bestaat er geen enkele geheimhouding ten aanzien van de verkrijgbaarheid of het kweken van de bacterie. Alleen over de `optimale' verspreidingsmethode, de bereiding van fijne poeders en nevels, is in de open literatuur vrijwel geen informatie te vinden. Dat heeft ertoe geleid dat zelfs Irak geen goed antrax-wapen heeft kunnen produceren.

Onder de microscoop onderscheidt de antrax-bacterie zich nauwelijks van andere Bacillus-soorten. Antrax-bacillen zijn eniszins rechthoekige, onbeweeglijke staafjes die nogal eens korte ketens vormen. Dan lijken ze op treinwagons. De cellengte kan oplopen tot 5 micron. De spore, de bovengenoemde overlevingsstructuur, is iets kleiner. Alle virulente antrax-stammen vormen onder gunstige omstandigheden, zoals in het bloed, een karakteristiek `kapsel' rond de cel. Dat kapsel, niet te verwarren met de spore, is met speciale kleuringen goed zichtbaar te maken: een diagnostisch kenmerk. Het kapsel beschermt de bacterie tegen vertering door de zogenoemde macrofagen, de speciale cellen uit het afweersysteem van hogere diersoorten die vreemde cellen opruimen. Antrax-stammen zonder kapsel zijn nauwelijks of niet ziekteverwekkend. De eigenlijke virulentie dankt de antrax-bacil aan de productie van twee eiwitachtige gifstoffen (toxinen) die in totaal uit drie componenten bestaan. Het beschermend antigen PA (protective antigen) is de component die een porie maakt in de membraan van de gastheercel waardoor de twee andere componenten toegang krijgen tot het inwendige van de cel (waar zij hun schade aanrichten).

Plasmiden

De genetische informatie voor de aanmaak van kapsels en toxinen is niet binnen het gewone bacterie-chromosoom, het genoom, aanwezig maar is opgeslagen in twee kleinere losse DNA-ringen die plasmiden worden genoemd. Het plasmide pXO1 bevat de informatie voor de vorming van kapsels, het plasmide pXO2 dat voor de toxinen. Ook resistentie tegen antibiotica is vaak in de plasmiden gecodeerd. Over het algemeen kunnen bacteriën nogal makkelijk een plasmide kwijt raken of overnemen van een andere bacterie. Verliest de antrax-bacterie één van zijn twee plasmiden dan is hij niet gevaarlijk meer.

Uit proeven met muizen en cavia's blijkt dat de diverse antrax-stammen enorm verschillen in hun virulentie. Kapselloze stammen, zoals de Sterne-stam die wordt gebruikt voor vaccins, zijn vrijwel ongevaarlijk. De Vollum- en Buffalo-stammen zijn wel ziekteverwekkend, de Ames-stam blijkt zelfs uiterst virulent. (Kort na de antrax-uitbraak in Florida is bericht dat het hier een Ames-stam betrof. Daar is later niet meer op teruggekomen.) Op internet zijn de eigenschappen van de tientallen isolaten die in de loop van de decennia zijn verzameld gerubriceerd. Ze verschillen, afgezien van hun virulentie, onder meer in gevoeligheid voor antibiotica en in de hoeveelheden toxine die ze produceren.

Treinwagons

Het aantonen van antrax in lichaamsvocht of weefselsmonsters is nooit een probleem geweest. De antrax-bacillen zijn goed kleurbaar waardoor de `treinwagons' in microscopische preparaten snel opvallen. Bij het kweken op bloed-agar ontstaan heel karakteristieke koloniën. Ook is er een virus, de gamma-bacteriofaag, dat zeer specifiek antrax-bacteriën aanvalt en oplost. De grote gevoeligheid voor penicilline is een ander diagnostisch kenmerk. Definitief uitsluitsel kwam vroeger van dierproeven. Veel van deze klassieke testen zijn inmiddels vervangen door DNA-analyse. Met behulp van de polymerase-kettingreactie (PCR) is uit te maken of er überhaupt sprake is van een antrax-infectie. Met behulp van DNA-fingerprinting kan de desbetreffende stam worden geïdentificeerd. Aangenomen mag worden dat de FBI precies weet welke antrax-stammen zijn verspreid, maar er uit tactische overwegingen het zwijgen toe doet.

Veel van het huidige antrax-onderzoek is gericht op een snellere detectie van de bacterie en op de bereiding van betere vaccins. Op dit moment zijn er twee soorten vaccins. De ene soort, die voornamelijk een veterinaire toepasing kent maar in Rusland ook voor mensen wordt gebruikt, bestaat uit levende, maar verzwakte (want kapselloze) antrax-cellen. In het Westen vindt men dit vaccin niet veilig genoeg. In Engeland en de VS bereidt men vaccins uit gezuiverde, celvrije oplossingen van het beschermend antigen PA dat gehecht is aan aluminiumhydroxide. (Het aluminium versterkt de afweerreactie.) Het bezwaar van dit laatste zogeheten AVA-vaccin is dat pas na zes injecties voldoende bescherming ontstaat. Een onderzoeksgroep in Boston heeft (Science, 27 april 2001) een antrax-bacterie `gemaakt' die een zwaar gemuteerd antigen PA produceert. Dit antigen maakt geen bruikbare poriën meer maar houdt de aanhechtingsplaatsen op de celmembraan wel bezet. Zo'n gemuteerde stam zou als tegengif bij een antrax-besmetting goede diensten kunnen bewijzen.

Met dank aan dr. Ph.J. van Dalen, TNO Preventie en Gezondheid, Leiden