En maar pompen

In de membranen van elke cel zitten pompjes die chemicaliën naar binnen en buiten transporteren. Onderzoekers van het Nederlands Kanker Instituut ontwikkelden een techniek waarmee ze de pompjes real-time kunnen volgen.

Voor het eerst zijn werkende chemicaliënpompen in levende cellen te zien. Onderzoekers van het Nederlands Kanker Instituut (NKI) in Amsterdam maakten de poortjes zichtbaar in de membranen rond de cellichaampjes. Die gaan voortdurend open en dicht om allerlei chemicaliën in en uit te pompen. Met behulp van fluorescentietechnieken konden de onderzoekers deze pompen (transporters) in actie zien, en ook beïnvloeden.

Zo blijkt bestraling of toevoeging van sommige chemicaliën aan de celkweek te leiden tot een enorme extra pompactiviteit in de membranen, omdat er na zo'n behandeling een overmaat aan beschadigde eiwitten moet worden opgeruimd. Andere stoffen blijken het pompmechanisme juist lam te leggen. Met de aan het NKI ontwikkelde techniek is dat allemaal real-time te volgen onder de microscoop. Volgens Nature betreft het een verbazingwekkend staaltje van `single cell biochemistry'.

``We werken met een weefselkweek van levende kankercellen'', vertelt onderzoeker dr. Jaques Neefjes, tevens hoogleraar aan de Universiteit van Leiden. ``Kanker staat hier nu eenmaal centraal en bovendien kun je met kankercellen goed werken, omdat zij zich in weefselkweek voortdurend blijven delen.'' Uit de broedstoof, precies 37,5 graden Celsius, pakt hij een glazen schaaltje met een vloeibare kweek van menselijke kankercellen en legt het onder de microscoop. Je ziet de cellen traag bewegen.

Neefjes: ``We doen dit onderzoek omdat onderzoekers wereldwijd geïnteresseerd zijn in de ontwikkeling van immunotherapie. De hoop is om het immuunsysteem op den duur in te zetten tegen kanker. Daarmee zou je kankercellen veel selectiever kunnen doden dan met de bestaande chemotherapieën, die nogal grof zijn.'' De grote vraag hierbij is: hoe herkent het immuunsysteem een kankercel? Hoe kan het immuunsysteem aan de buitenkant al zien dat binnenin de cel een gemuteerd eiwit, een kankereiwit, zit? ``Daarvoor hopen we gebruik te maken van het systeem van antigen presentatie'', zegt Neefjes. ``Aan de buitenkant van elke lichaamscel wordt getoond wat er binnenin die cel zoal aan eiwitten zit.''

Een gewone lichaamscel bevat wel 30.000 tot 40.000 verschillende eiwitten. Daarvan worden voortdurend kleine fragmentjes uitgescheiden en deze antigenen belanden op het celoppervlak. Stel dat je een virusinfectie oploopt, dan worden ook brokjes viruseiwit uitgescheiden naar het celoppervlak. Miljoenen killercellen van het immuunsysteem snuffelen voortdurend de lichaamscellen af op zoek naar zulke eiwitvlaggetjes die melden: deze cel is besmet en moet worden opgeruimd.

Ook antigenen van sommige kankereiwitten belanden op het celoppervlak, herkenbaar voor het immuunsysteem. Volgens sommige onderzoekers ontstaan in het dagelijks leven voortdurend beginnende kankercellen die door de killercellen weer worden opgeruimd, maar echt aangetoond is dat niet. ``Aan toepassing van immunotherapie zitten ook nog veel haken en ogen, zoals auto-immuunreacties'', zegt Neefjes. ``In elk geval moet je het systeem van antigenpresentatie kennen en je moet weten hoe je kunt bevorderen dat een cel de benodigde eiwitfragmenten (antigenen) naar buiten gaat pompen. Daarom bestuderen we dat pompmechanisme in levende cellen.''

verkeerd gevouwen

Uit de publicatie van de NKI-onderzoekers in Nature blijkt dat maar liefst een derde van alle nieuw aangemaakte eiwitten in de cel meteen weer wordt afgebroken, bijvoorbeeld omdat ze verkeerd gevouwen zijn. Ook verouderde eiwitten worden opgeruimd. Overtollige eiwitten worden `verhakseld' en de brokstukken (peptiden) afgevoerd via moleculaire pompen of transporters in het celmembraan. Transporters die betrokken zijn bij antigenpresentatie worden TAP's (transporter associated with antigen presentation) genoemd. Ze binden de peptiden en pompen ze door de membraan heen. ``Daarna moet het poortje snel weer dicht, anders zou de cel doodgaan,'' zegt onderzoeker Eric A.J. Reits. ``Zowel het openen als het sluiten kost energie.'' Reits begon eind 1996 bij Neefjes aan een promotie-onderzoek naar deze TAP's.

Om te zien wat er in de levende cel gebeurt nam hij zijn toevlucht tot een groen fluorescerend eiwit (Green Fluorescent Proteïn of GFP genoemd). Dit eiwit, oorspronkelijk afkomstig uit een kwal, is nu zeer populair in het biochemisch onderzoek. Reits: ``Als je dat fluorescerende eiwit aanstraalt met blauw licht, licht het onder de microscoop groen op. Het leuke is dat je dat kwallen-eiwit kunt binden aan allerlei eiwitten in de cel. Wij binden het GFP-eiwit aan onze pomp. En in de cel gebracht nestelt het zich in een membraan. Onder de microscoop zie je de pompmoleculen groen oplichten en zodat je kunt volgen hoe de pomp zich in een celmembraan beweegt.''

Die pompen liggen niet stil in de membranen in de cel, maar diffunderen binnen die scheidingslaag die bestaat uit een soepele dubbellaag van vetzuurmoleculen. De onderzoekers kunnen niet zien of de pomp ook echt pompt, maar ze weten wel dat de pomp niet zo snel binnen het membraan verschuift (diffundeert) als hij aan het pompen is.

Om dat aan te tonen past Reits een truc toe. Met behulp van een zeer krachtige laserstraal laat hij al het GFP in een bepaald plekje van de cel uitdoven. Deze tactiek wordt bleaching genoemd. ``Alle fluorescentie verdwijnt, je ziet letterlijk een zwart gat in het membraan'', wijst Reits. ``Maar je ziet dat zwarte gat ook weer snel verdwijnen door het toestromen van nog steeds fluorescerende pompen, die buiten de gebleachte plek zaten. Dat zijn pompen uit de buurt, die het uitgedoofde gebied binnenstromen.''

Hoe sneller het zwarte gat wordt opgevuld, hoe hoger de diffusiesnelheid van deze pompen. ``Door middel van de diffusiesnelheid meet je dus de activiteit van de pomp'', zegt Reits.

Overigens bestaan er ook eiwitten die zich middenin de pomp nestelen, zodat deze geblokkeerd raakt. Sommige virussen, zoals het Humaan Cytomegalovirus, zorgen er met pompblokkerende eiwitten voor dat hun resten niet aan het celoppervlak worden gepresenteerd. Zo kan het virus een cel overnemen zonder aan het immuunsysteem te worden verraden.

In een reeks experimenten spoot Reits met een micro-injector allerlei extra stoffen in de cellen, die gemiddeld een tiende millimeter groot zijn, gespoten om de pompwerking te stimuleren of juist te vertragen. Reits: ``Je ziet dan bijvoorbeeld dat er na een infectie met griepvirus in een cel eerst heel veel nieuwe viruseiwitten worden aangemaakt en vervolgens al snel ook weer afgebroken. Onder de microscoop zie je dan een trage verplaatsing van de pompen, want de pompen werken op maximale capaciteit.''

Neefjes: ``Je kunt die informatie gebruiken: hoe lager de diffusiesnelheid, hoe meer open, werkende pompen er zijn, en dus zijn er dan meer peptiden in de levende cel aanwezig die vervolgens aan het celoppervlak aan het immuunsysteem kunnen worden gepresenteerd. Dat proces willen we in de vingers zien te krijgen om immunotherapieën te ontwikkelen. Bovendien kan deze techniek worden ingezet om beter te bekijken wat er precies op celniveau gebeurt als een tumor wordt bestraald, of hoe hij op chemicaliën reageert.''

    • Marion de Boo