Onkruid vergaat niet

Onkruid vergaat niet, en geen wonder. Een onooglijk onkruidje als Arabidopsis thaliana (zandraket) heeft honderden resistentiegenen in huis tegen alle denkbare ziekten en plagen. Wageningse moleculair-biologen sporen deze genen in ijltempo op. Voor het eerst wordt het complete genoom van een plant onthuld.

`Als afstudeerproject heb ik de volgorde van vierentwintig basenparen vastgesteld. Prachtig toch?' Moleculair bioloog prof.dr. Willem Stiekema (49) schiet in een daverende lach. De vier automatische ultra high throughput sequencers die onlangs voor zijn Wageningse lab Greenomics werden aangeschaft, lezen tezamen anderhalf miljoen basenparen per dag af, dag in, dag uit. Hier worden in een razend tempo de geheimen van het DNA van planten, bacteriën en andere organismen onthuld. Met deze apparaten, de krachtigste in hun soort, kan het complete genoom – dat is het totale DNA-pakket – van een bacterie in enkele weken worden beschreven. Momenteel heeft men een melkzuurbacterie onder handen.

Stiekema is hoofd van de vijftig man sterke afdeling Moleculaire Biologie van het Centrum voor Plantenveredelings- en Reproduktieonderzoek (CPRO) in Wageningen en buitengewoon hoogleraar bio-informatica, de eerste in Nederland. Bio-informatici moeten de gigantische informatie-explosie in de moleculaire wetenschappen in goede banen leiden. ``Je kunt prachtige dwarsverbanden leggen'', zegt Stiekema. ``Zo leidde een studie naar de manier waarop planten licht waarnemen tot de ontdekking van de genen die de biologische klok van muizen bepalen.''

``Kijk, die sequenties worden achter mekaar uit de grond gestampt'', wijst Stiekema en raapt een grafiek van tafel op. Die staat vol met pieken en piekjes in vier verschillende kleuren, corresponderend met de vier bouwstenen van het DNA: de basen A, C, G en T. Groen staat voor adenine, blauw voor cytosine, zwart voor guanine en rood voor thymine.

De DNA-code wordt afgelezen als een lange sliert letters, ATGATTGTTCTA enz. enz. Drie opeenvolgende letters, een triplet, coderen voor een aminozuur. Er bestaan twintig verschillende aminozuren als bouwstenen van de eiwitten. Als de sequencer een letter verkeerd afleest, levert dat soms een fout aminozuur op. Veel vervelender is het als de machine per ongeluk een base overslaat, want dan worden alle volgende tripletten in de rest van het gen verkeerd afgelezen. ``Om zulke fouten op te sporen lezen we alle DNA-fragmenten of klonen voor de zekerheid zes keer af'', zegt onderzoeker René Klein Lankhorst, die het laboratorium leidt. ``Je moet onze score van anderhalf miljoen basenparen per dag dus door zes delen. We hebben een foutenmarge van een op de tienduizend.''

bio-informatica

De meetgegevens worden meteen doorgesluisd naar de aangrenzende computerruimte om te worden geanalyseerd. Want het aflezen van de genetische code is één ding, het uitzoeken waar al die genen liggen en wat ze doen is een tweede. Hiervoor wordt de DNA-code van elk aangetroffen gen via Internet vergeleken met gegevens van andere levende wezens in databanken over de hele wereld. In 1987 waren zo'n 10 miljoen gensequenties bekend, vorig jaar al 10 miljard. ``Het gistgenoom is bekend, en dat van de nematode C. elegans en flinke delen van het genoom van de fruitvlieg en van een groot aantal bacteriën'', somt Willem Stiekema op. ``Soms lijkt een planten-gen op een gen dat in een bacterie betrokken is bij de citroenzuurcyclus. Zo hebben we van ongeveer de helft van de genen een vaag vermoeden van wat ze doen. Van de rest weten we nog helemaal niets.''

In totaal is acht miljoen gulden geïnvesteerd. Voor allerlei opdrachtgevers wordt nu het DNA van allerlei organismen tegen betaling gesequenced. Een andere mogelijke bron van inkomsten zijn patenten op interessante vondsten. Zo kreeg het CPRO een paar weken geleden een Amerikaans patent op een door Stiekema's groep ontdekt gen voor mannelijke steriliteit. Het boekwerkje van het Patent and Trade Mark Office heeft een gouden medaillon met twee rode strikken op de kaft. Het patent is twintig jaar geldig. ``Een kwestie van kennisbescherming. Of het geld gaat opleveren is de vraag. Maar je kunt je als instituut niet permitteren om zo'n vondst niet te patenteren, want dan gaat een ander ermee aan de haal'', zegt Stiekema. ``Als een andere academische groep hier onderzoek mee wil doen, sturen wij dat gen gewoon op. Maar we willen onze vondsten wel beschermen. De wereld zou er mooier uitzien als dat niet hoefde en als de geldkraan voor ons instituut gewoon openstond, maar zo is het nu eenmaal niet.''

Favoriet studieobject van Stiekema's groep is Arabidopsis thaliana, de zandraket. Een onooglijk onkruidje, telg uit de kruisbloemigen- of koolfamilie, met een simpele bladrozet en witte bloemetjes. Vanwege zijn korte generatieduur is Arabidopsis onder genetici bijna net zo populair als de fruitvlieg. Het plantje heeft maar vijf paar chromosomen en een compacte hoeveelheid DNA, zo'n 130 miljoen basenparen. Daarop liggen circa 25.000 genen en maar weinig junk-DNA. Stiekema: ``Junk-DNA bestaat vaak uit eindeloze herhalingen van dezelfde basenparen, bijvoorbeeld almaar GTGTGTGT. Dat is lastig te sequencen en misschien niet bijster interessant.''

Van Arabidopsis wordt als eerste plant ter wereld het complete genoom in kaart gebracht. Diverse Europese groepen, waaronder die van Stiekema, werken hieraan sinds 1993 samen. In 1996 traden een Amerikaanse en een Japanse groep toe tot het Arabidopsis Genome Initiative. Stiekema's groep werkt aan chromosoom 4. ``Chromosoom 2 en 4 worden dit jaar gepubliceerd, de rest volgt volgend jaar'', vertelt de moleculair bioloog. ``Hierna gaan we verder met rijst en andere gewassen.''

pseudogenen

Om de vaart erin te houden kijkt het computerprogramma alleen naar eiwitten van ten minste 100 aminozuren. Kleinere eiwitten blijven voorlopig buiten beschouwing. ``Een zwak punt van de huidige programmatuur'', vindt Stiekema. ``Bij planten kunnen kleine eiwitjes best belangrijk zijn. Overigens worden de programma's voor elk nieuw te sequencen organisme aangepast. Zo is voor Arabidopsis vorig jaar een nieuwe versie van het programma Genscan gemaakt. We komen ook regelmatig pseudogenen tegen, dat zijn genen die gemuteerd en niet meer functioneel zijn. Hoe meer gegevens je krijgt, hoe beter je je computerprogramma's kunt `opvoeden'.''

Volgens Stiekema moeten veel moleculair biologen nog wennen aan het idee dat ze straks niet meer in hun witte jas zitten te pipetteren, maar eerst maandenlang achter de computer moeten om hun experiment door te denken en alle beschikbare informatie over het betrokken organisme in databases op te vragen. ``Straks zitten alle genen van Arabidopsis in een database'', zegt Stiekema. ``Zelf een gen isoleren is er straks niet meer bij, je kunt dat veel sneller opvragen in wereldwijde stockcentra.''

Wat doen al die duizenden genen in de plant nou eigenlijk? Om daar achter te komen dient de transposon-techniek, ontwikkeld door Andy Pereira. Een transposon is een klein stukje DNA dat je willekeurig in het genoom schiet. Hierdoor kan een gen worden uitgeknockt. Dat kan leiden tot een plant met een afwijkend uiterlijk. Als de plant mannelijk steriel wordt, is kennelijk een gen voor mannelijke vruchtbaarheid geraakt. Zo kunnen allerlei mutanten ontstaan, ook biochemische mutaties, die niet in één oogopslag te zien zijn. Soms ziet men pas een afwijkend type nadat twee, drie of vier verschillende genen zijn uitgeknockt. Men kan ook uitgeknockte planten met elkaar kruisen. Door telkens weer andere genen uit te schakelen ontstaat geleidelijk meer inzicht in hun werking.

Stiekema: ``Er zijn al ruim 10.000 transposons in het Arabidopsis-DNAgezet en dat moeten er honderdduizenden worden. Door telkens het aangrenzende stukje DNA, de flankerende sequenties, af te lezen kun je al die verschillende transposons op de vijf chromosomen van Arabidopsis in kaart brengen, zodat je precies weet in welk gen het transposon is beland. Maar dat is nog een heel werk.''

Vaak wordt een eigenschap bepaald door diverse genen. Over hun onderlinge interactie is weinig bekend. Stiekema: ``Sommige genen werken als communicerende vaten. Als de ene minder hard gaat werken, wordt de andere juist actiever. Soms schakel je een gen uit en dan gebeurt er helemaal niets, dan neemt een ander gen kennelijk de functie over. In de bio-informatica proberen mensen al die gegevens te koppelen om daaruit een soort virtuele cel en uiteindelijk een virtueel organisme op te bouwen, die je ook op Internet kunt vinden.''

clusters

Te midden van al die duizenden genen gaat Stiekema's grootste interesse uit naar resistentiegenen die planten beschermen tegen allerlei ziekten en plagen, zoals aaltjes en schimmels. ``Die resistentiegenen blijken vaak in clusters bijeen te liggen. Soms liggen er wel tien van die genen op een rijtje, en dan is de vraag welke nu het echte resistentiegen is. Om beurten schieten we dan in alle tien die genen transposons. Levert dat ineens een vatbare plant op, dan is er blijkbaar een resistentiegen geraakt.''

Het allereerste resistentiegen dat onderzoekers in handen kregen betrof een gen voor bladvlekkenziekte-resistentie bij tomaat, in 1994 gevonden op het John Innes Institute in Kent. De tomaat bleek een heel rijtje van deze genen te bezitten. Toen hun DNA-code eenmaal bekend was, kon men soortgelijke genen ook gemakkelijk in Arabidopsis opsporen. Ook daar bleken diverse resistentiegenen bij elkaar te liggen, bijvoorbeeld op chromosoom 4, voor resistentie tegen valse meeldauw. Zoals alle onkruiden zit ook Arabidopsis barstensvol met resistentiegenen, tegen honderden verschillende schimmels, bacteriën, virussen.

Van Arabidopsis naar koolgewassen, die tot dezelfde familie behoren, is een stap die veredelaars al volop zetten. Hele stukken van het genoom komen overeen. Lastig is wel dat die koolplanten dan vaak aan nèt weer iets andere varianten of fysio's van zo'n schimmelziekte lijden. Daardoor werken die resistentiegenen uit Arabidopsis dan waarschijnlijk toch net weer niet goed in een koolplant.

``Maar dat kan óók liggen aan het feit dat wij nog niet echt goed weten hoe die resistentiegenen werken'', merkt Stiekema op. ``Op de een of andere manier herkent de plant zijn belager aan bepaalde signalen en reageert daarop bijvoorbeeld doordat het besmette plantenweefsel afsterft. Als je precies zou weten hoe dat mechanisme werkt, zou je misschien wel een breed-spectrum resistentiegen kunnen maken. Daarmee staan we pas aan het begin. Heel interessant is dat deze cascades, deze kettingreacties waarin achtereenvolgens allerlei genen worden aangeschakeld, bij planten en dieren heel veel op elkaar lijken. Door die gegevens van verschillende signaaltransductiepathways te koppelen gaat het onderzoek met grote sprongen vooruit.''

Schimmels blijven lastige organismen omdat ze zichzelf voortdurend veranderen. Maar juist daarom is het onderzoek naar schimmelresistentie hard nodig, vindt Stiekema. Daardoor kan het gebruik van giftige schimmeldodende middelen in de landbouw omlaag.

Zojuist deed hij, samen met Wageningse collega's, een fascinerende ontdekking die waarschijnlijk binnenkort in Nature Biotechnology wordt beschreven. ``We ontdekten twee resistentiegenen in aardappel die als twee druppels water op elkaar leken. Merkwaardig genoeg beschermt het ene gen tegen een virusziekte en het andere tegen een aaltje. Niemand had zoiets ooit verwacht.''

rijstgenoom

De stap van Arabidopsis naar bijvoorbeeld tarwe is voor veredelaars lastig te zetten, omdat deze gewassen onderling weinig verwant zijn. Daarom hebben onderzoekers hun oog nu op rijst laten vallen. Rijst hoort net als tarwe tot de granenfamilie, maar heeft, net zoals Arabidopsis, een opmerkelijk compact genoom met weinig junk-DNA. Het genoom omvat ongeveer 400 miljoen basenparen. Tarwe heeft juist een krankzinnig groot genoom, minstens 40 keer zo groot als rijst. ``Rijst is eigenlijk een ideale modelplant, want je kunt hem ook nog eten'', aldus Stiekema.

Het sequencen kost zo'n 50 cent per basenpaar, vijfmaal zo goedkoop als een jaar of vier geleden. Maar het aflezen van het complete rijstgenoom van 400 miljoen basenparen zou dan altijd nog 200 miljoen gulden kosten. Stiekema: ``Op het CPRO is daar een eerste begin mee gemaakt. We willen graag wereldwijd gaan samenwerken, want het valt niet mee om zo'n bedrag bij elkaar te krijgen. Maar als je ziet wat je daarvoor krijgt vind ik het nog steeds goedkoop. Vergeleken met het ruimtevaartonderzoek is het peanuts!''

Een van de leukste aspecten aan de moderne biologie vindt hij de efficiënte samenwerking tussen onderzoekers. ``We hadden laatst een wetenschappelijke publicatie met een recordaantal van 65 auteursnamen erop. En binnenkort verschijnt er eentje over plantenchromosomen met nog veel meer auteurs. Vroeger zag je dat alleen bij de deeltjesversnellers!''

    • Marion de Boo