Duistere tijden

Even slapen, even waken, de hele dag door. Bij muizen waarbij de genen cry1 en cry2 zijn weggehaald stort de biologische klok in.

Twee jaar geleden zocht dr. Bert van der Horst, verbonden aan de afdeling Celbiologie en Genetica van de Erasmus Universiteit in Rotterdam, naar genen die een rol spelen bij DNA-reparatie, het proces waarmee cellen schade aan DNA herstellen. Hij vond genen, maar niet wat hij zocht. Cry1 en cry2 hadden met DNA-reparatie niks te maken. Ze bleken onderdeel van de biologische klok, zo ontdekte de geneticus. Als muizen deze twee genen missen dan ontspoort hun klok en verdwijnt hun normale dag-nacht-ritme. De dieren gaan slapen op onvoorspelbare momenten en worden net zo plotseling weer wakker. Dat patroon van even-slapen-even-waken herhaalt zich soms wel tien keer per dag. Normaal slaapt een muis overdag zonder onderbreking, 's nachts is hij voortdurend actief. Afgelopen donderdag publiceerde Van der Horst en zijn team de, onverwachte, resultaten in Nature. Hij voerde het onderzoek uit met wetenschappers van het Nederlands Instituut voor Hersenonderzoek in Amsterdam en van de Tohoku Universiteit in Sendai (Japan).

Gisteren verschenen er trouwens ook in Science twee artikelen over de biologische klok. Science hief het embargo op die stukken vroegtijdig op. Woensdagmiddag mochten journalisten er al over schrijven, een dag eerder dan normaal. Science wilde het nieuws tegelijkertijd met Nature beschikbaar hebben. ``Het onderzoek aan de biologische klok krijgt veel aandacht. Het klok-wereldje is vreselijk hectisch op het moment. De competitie is moordend'', aldus Van der Horst. ``Dat komt omdat vorig jaar de eerste klokgenen van zoogdieren zijn gevonden. Science zette die vondst op plaats vier in de jaarlijkse top-tien van belangrijke wetenschappelijke ontdekkingen. Sindsdien is de zaak goed gaan rollen.''

Inmiddels hebben de Rotterdammers al aanvragen uit Amerika en Japan binnen voor de muizen die cry1 en cry2 missen. ``De muizen zijn gewild, het nieuws gaat snel rond'', zegt prof.dr. Jan Hoeijmakers, leider van de Rotterdamse genetica-afdeling. Dat merkte hij trouwens ook toen hij het artikel vorig jaar november aan Nature had aangeboden. ``Een van de referenten die het artikel beoordeelde, heeft waarschijnlijk gelekt naar Science. We werden door de Amerikanen benaderd met de vraag of we onze resultaten niet in hun tijdschrift wilden publiceren. Dat hebben we toen doorgegeven aan de mensen van Nature. Die waren woedend. Ze verboden ons om verder contact te hebben met Science. Uiteindelijk is alles toch in den minne geschikt. Science mocht de gegevens wel inzien voor een overzichtsartikel in hun nieuwsrubriek. Maar het geeft aan hoe het er op het moment aan toegaat in de klok-wereld.''

pure mazzel

Dat Van der Horst zijn naam nu heeft gevestigd in het `klok-wereldje' noemt hij ``pure mazzel''. Enkele jaren geleden begon hij zijn zoektocht naar genen die zijn betrokken bij het herstel van DNA-schade. DNA kan op verschillende manieren beschadigd raken. Onder andere door de instraling van UV-licht. Planten en bacteriën bezitten enzymen waarmee ze die schade snel kunnen herstellen. Fotolyasen heten die enzymen. Van der Horst: ``De enzymen werken als een soort zonnepanelen. Ze vangen licht op en gebruiken de opgevangen energie om schade aan het erfelijk materiaal te repareren.''

Onlangs werd bij de kangaroe zo'n fotolyase ontdekt. Ook dit enzym bleek een rol te spelen bij DNA-reparatie. Maar de kangaroo behoort tot de buideldieren. Die baren hun jongen vroeg en brengen ze groot in een buidel. Bij placentale zoogdieren, zoals muis en mens, blijft het embryo veel langer in de baarmoeder. Voor de voedselvoorziening ontwikkelen deze zoogdieren een placenta. Van der Horst: ``Van placentale zoogdieren is nooit aangetoond dat ze fotolyasen gebruiken bij herstel van DNA-schade door UV-licht. Wij wilden uitzoeken of deze diersoorten wel erfelijke informatie voor fotolyasen bezitten.''

Dat bleek het geval. Peter van der Spek en André Eker, collega's van Van der Horst, speurden in DNA-databanken, en vonden wat ze zochten: twee muizengenen, cry1 en cry2. Ze leken veel op het kangaroo-gen dat codeert voor fotolyase. Maar met DNA-reparatie hadden ze niks te maken. Waartoe dienden ze dan? Van der Horst: ``Tijdens een werkbespreking zei iemand voor de grap: misschien zijn het onderdelen van de biologische klok. De klok wordt namelijk iedere dag ietsje bijgesteld onder invloed van het daglicht. En wat vangt dat licht op? Misschien die fotolyasen?''

Van der Horst en zijn collega's maakten vervolgens mutante muizen. De muizen misten óf het cry1-gen, óf het cry2-gen, óf beide genen. De muizen werden in een proefopstelling gezet waarbij de dag verdeeld was in 12 uur duisternis en 12 uur licht.

Al die muizen sliepen als het licht was, zoals elke muis in het wild ook doet. ``Evolutionair bepaald gedrag'', zegt Hoeijmakers ervan. ``Muizen zijn nachtdieren. Ze vertonen zich niet in het licht, want dan vallen ze erg op en zijn ze een makkelijke prooi. Licht is dus een sterke prikkel voor de muis om zich gedeisd te houden. Het onderdrukt elke neiging tot actief gedrag.'' Zodra het licht uitging kropen de muizen in de tredmolen. Hoeijmakers: ``In twaalf uur leggen ze soms wel tien kilometer af.''

Het gedrag veranderde pas als het licht dagen uit bleef en de muizen in duisternis leefden. Hun dag-nacht-ritme verschoof. De klok ging in zijn eigen tempo tikken. Bij normale muizen duurt een dag volgens het ritme van de biologische klok dan 23 uur en 42 minuten. Muizen die het cry1-gen missen, hebben de dag er al na 22 uur en 30 minuten opzitten. En bij muizen die het cry2-gen misten was de klok pas na 24 uur en 36 minuten rond. Zonder cry1 en cry2 is er van een klok amper meer sprake. Periodes van slaap en activiteit wisselen elkaar snel en onvoorspelbaar af. Dus, zo concluderen de auteurs in hun Nature-artikel, de genen cry1 en cry2 en de coderende eiwitten zijn essentieel voor het behoud van het circadiane ritme en ze kunnen de klok bijstellen.

De Rotterdammers toonden zich in eerste instantie verbaasd dat het effect van een mutatie pas bij voortdurende duisternis zichtbaar wordt. In een 12-uur-licht-12-uur-donker ritme blijft de klok behoorlijk in het gareel lopen. ``Dat heeft te maken met het maskerende effect van licht'', legt Hoeijmakers uit. ``Kijk bijvoorbeeld naar de muizen die cry1 missen. Hun klok is binnen 22 uur en 30 minuten rond, een dag duurt dus anderhalf uur korter dan de bedoeling is. Je ziet de muizen soms al wakker worden terwijl het nog licht is. Ze worden even actief, maar gaan niet in de tredmolen. Het licht onderdrukt dat gedrag, het licht is voor de muis een teken van gevaar: kijk uit, je valt op, je bent een makkelijke prooi. De klok wordt dus overruled, ook al wil die de muis aanzetten tot activiteit. Dit heeft nog nooit iemand zich gerealiseerd.''

De volgende vraag was: waar komen de cry-genen tot expressie? ``Overal'', aldus Hoeijmakers. Alle cellen in het muizenlichaam blijken het cry1- en het cry2-gen in meer of mindere mate af te lezen en de coderende eiwitten aan te maken. ``Maar op twee plekken zie je de eiwitten in hoge concentraties, namelijk in een hersengebiedje, daar waar het centrum van de klok zich bevindt. En in het oog, in de zogeheten inner nuclear layer van het netvlies. Dat is een laag cellen die net onder de cellagen met de kegeltjes en staafjes ligt.''

Zijn de eiwitten CRY1 en CRY2 dan de felgezochte lichtreceptoren die de biologische klok aansturen? ``Ik denk van wel'', zegt Hoeijmakers. ``Onze gegevens passen in ieder geval mooi bij de resultaten uit Science.''

De auteurs van de Science-artikelen, verbonden aan het Imperial College of Science, Technology and Medicine in Londen en de Universidad de Oviedo, maakten mutante muizen. De muizen misten de kegeltjes die gevoelig zijn voor groen licht (golflengte om en nabij de 500 nm). Ook de staafjes, gevoelig voor grijstinten, ontbraken volledig. Toch was de biologische klok van de muizen te beïnvloeden door de muizen te beschijnen met monochromatisch groen licht. Het dag-nacht-ritme van de klok verschoof afhankelijk van het tijdstip van belichting. Ook de afgifte van het hormoon melatonine bleef beïnvloedbaar. Melatonine wordt tijdens de nacht afgegeven door de pijnappelklier en beïnvloedt onder andere de lichaamstemperatuur. De afgifte van het hormoon hangt sterk samen met het ritme van de biologische klok. De auteurs concluderen dat de lichtreceptoren in staafjes en groen-gevoelige kegeltjes niet dé lichtreceptoren zijn die de biologische klok aansturen.

ogen verwijderen

Toch moeten die lichtreceptoren zich in ergens in het oog bevinden. Want bij muizen waarvan de ogen waren verwijderd, is de biologische klok niet langer te beïnvloeden met monochromatisch groen licht. Dat bleek uit eerder onderzoek ``Dus, wie weet'', zegt Hoeijmakers, ``misschien zijn CRY1 en CRY2 in de inner nuclear layer de gezochte lichtreceptoren. Dat willen we nu gaan onderzoeken.''

De Rotterdammers beschikken inmiddels over een speciale muizenstam. De dieren lijden aan het Cockayne Syndrome, een aangeboren aandoening die ook bij mensen voorkomt. Pasgeboren muizen verliezen binnen drie maanden bijna al hun staafjes en kegeltjes in het netvlies. De inner nuclear layer blijft echter intact. ``We willen deze muizen gaan kruisen met de muizen die de genen cry1 en cry2 missen. Hoe zal de klok van deze muizen op lichtprikkels reageren?''

Behalve CRY1 en CRY2 zijn er nog andere kandidaten. Vorig jaar publiceerden Scott Campbell en Patricia Murphy in Science dat de biologische klok van 15 proefpersonen te beïnvloeden was door de knieholte te beschijnen met licht (16 januari, 1998). De ogen van de vrijwilligers waren afgeplakt zodat het netvlies geen lichtsignaal opving. In een commentaar werd gesuggereerd dat bloedeiwitten zoals hemoglobine en billurubine zouden kunnen dienen als lichtreceptoren. Hoeijmakers heeft zijn twijfels. ``Ik zou de proef nog wel eens herhaald willen zien. En áls de biologische klok zich al laat beïnvloeden via de knieholte dan heeft het volgens mij niks te maken met een stof als hemoglobine. Misschien dat CRY1 en CRY2 hier een rol spelen, de genen worden immers in elke lichaamscel afgelezen.''

Van der Horst hoopt dat hij voorlopig aan de biologische klok mag blijven werken. ``Het onderzoek aan DNA-reparatie blijft natuurlijk onze speerpunt. De klok is slechts een zijlijn, maar er zijn genoeg interessante vragen.'' Hij verwacht trouwens geen grote doorbraak van zijn hand. ``Daarvoor pakken we het te kleinschalig aan. Er zijn groepen die enorme opstellingen hebben. Dan zie je 300 kooien, in elke kooi een muis, en de belichting van al die kooien is individueel regelbaar. Wij houden het klein.''