Verknipte afweer

Een kind bouwt vooral in zijn eerste levensmaanden zijn afweersysteem op. Knip- en plakenzymen sleutelen dan aan genen in de afweercellen. Soms gaat dat mis en krijgt een kind leukemie.

ACUTE LYMFATISCHE leukemie (ALL) is de meest voorkomende kanker bij kinderen. Een kwart (94) van de 395 kinderen tot 15 jaar bij wie in 1995 kanker werd vastgesteld had ALL. Het is een woekering van onrijpe lymfocyten. Lymfocyten zijn witte bloedcellen met een gespecialiseerde taak bij de afweer tegen virussen, bacteriën, parasieten en andere lichaamsvreemde stoffen. De B- of T-lymfocyten zijn in aantal de op één na grootste populatie witte bloedcellen. Zij maken 20 tot 45% uit van de witte bloedcellen, waarvan er 4 tot 10 miljard in iedere liter bloed zitten. Bij ALL is een van de onrijpe lymfocyten tot ongeremde groei overgegaan.

Ieder mens kan ongeveer duizend miljard (10) verschillende B- of T-lymfocyten maken. De variatie is nodig om zoveel mogelijk verschillende indringers te kunnen herkennen. De B-cellen verschillen in de immuunglobulinen ofwel antistoffen die ze produceren en die veelal los in het bloed zwerven. Deze antistoffen binden aan binnengedrongen micro-organismen en lichaamsvreemde stoffen zodra ze die op hun weg tegen komen. De complexen worden herkend, verzwolgen en verteerd door macrofagen (een ander soort witte bloedcel). Iedere T-lymfocyten draagt een andere T-cel-receptor op zijn celoppervlak. Ook daarmee worden indringers herkend. T-lymfocyten binden met hun receptor aan indringers die ze vervolgens zelf afbreken. Zowel antistoffen als T-cel-receptoren zijn eiwitten met een karakteristieke Y-vorm.

B- en T-lymfocyten rijpen uit stamcellen. De creatie van lymfocyten met vele verschillende antistoffen en receptoren begint met genherschikking in onrijpe voorloper-lymfocyten. Uit grote, gefragmenteerde immuunglobuline- of T-cel-receptorgenen worden willekeurig verschillende stukjes DNA losgeknipt en aan elkaar geplakt totdat een aaneengesloten gen ontstaat dat voor een bruikbaar eiwit codeert. Voor het aan elkaar plakken beschikken lymfocyten over recombinase-enzymen.

``Bij ongeveer 25% van de kinderen die jaarlijks in Nederland ALL krijgen vinden we in hun woekerende witte bloedcellen een foutief gen dat is opgebouwd uit brokstukken van twee andere genen die aan elkaar geplakt kunnen zijn door die recombinase-enzymen. In een aantal gevallen is ook al vastgesteld dat die gencombinaties een eiwit opleveren die de wildgroei van de bloedcellen veroorzaken.'' Prof.dr. Jacques J.M. van Dongen, hoogleraar immunologie in het Academisch Ziekenhuis in Rotterdam, richt een groot deel van zijn onderzoekinspanning op het moleculaire proces dat tot leukemie leidt. Het lijkt oncologie maar blijft immunologie omdat het om de moleculen van het afweersysteem gaat. Het lijkt erop dat kinderleukemie een toevallige ramp is die soms optreedt bij de opbouw van een afweersysteem dat ieder mens behoedt voor ernstige, soms potentieel dodelijke infecties.

Dat juist kinderen vaak ALL krijgen is begrijpelijk voor wie naar de enorme lymfocytenproductie in de eerste levensjaren kijkt. Op zijn werkkamer pakt Van Dongen er een grafiekje bij. Bij een baby van een maand oud circuleren er 6,7 miljard lymfocyten in een liter bloed. Bij een kind van een jaar oud zijn het er nog 5,6 miljard, bij 10 tot 16 -jarigen 2,2 miljard en bij volwassenen 1,8 miljard.

Van Dongen: ``De 90 gevallen van ALL bij kinderen tot 15 jaar en de 80 ALL-patiënten bij alle mensen ouder dan 15 jaar komt me aannemelijk voor als het een kans is die evenredig is met de lymfocytenproductie. Op een productie van zoveel duizenden miljarden lymfocyten loopt het een enkele keer zo mis dat er leukemie ontstaat. De rijping van een lymfocyt gaat overigens veel vaker mis dan men zou denken, wel in zeventig procent van de gevallen, maar vrijwel altijd sterft zo'n cel. Daar heeft verder niemand last van.''

BESMETTINGSDRUK

Het verband tussen leukemie en de opbouw van het afweersysteem is al lang onderwerp van studie. Al in 1960 werden in de tumorcellen van leukemiepatiënten de eerste chromosoomtranslocaties gekarakteriseerd. Zo'n translocatie ontstaat doordat twee chromosomen breken. De brokstukken worden kruislings aan elkaar geplakt waarbij de kans bestaat dat de genen op het breukvlak niet meer, of verkeerd, functioneren. In de leukemiediagnostiek werden de door de microscoop zichtbare chromosoomafwijkingen gebruikt om de leukemie te karakteriseren. Biochemici kunnen nu de basenvolgorden van de genen op de breukplaatsen bepalen, waardoor veel bekend begint te worden over het mechanisme dat de leukemie veroorzaakt.

Een andere onderzoekslijn bewandelde de Britse leukemie-onderzoeker prof.dr. Melvyn Greaves. Hij onderbouwde een paar jaar geleden met epidemiologische gegevens de hypothese dat kinderen die in hun eerste twee levensjaren minder aan gewone infecties zijn blootgesteld vaker leukemie krijgen dan kinderen die `onder grote besmettingsdruk' leven. Een belangrijk argument voor Greaves was dat in het westen ongeveer tienmaal meer ALL bij kinderen voorkomt dan in Afrikaanse en Aziatische landen. Binnen Groot-Brittannië komt ALL meer voor bij kinderen van ouders met een goede opleiding en een goede baan (hoge economische status) die geïsoleerd opgroeien (enig kind, niet naar de crèche) dan kinderen uit grote gezinnen uit lagere sociale milieus. Greaves keek naar de ALL-variant van voorloper-B-lymfocyten die het merendeel (75%) van alle ALL uitmaakt en die in het Westen een piek vertoont op vierjarige leeftijd. Die piek ontbreekt echter in de Afrikaanse en Aziatische landen. Greaves kent de tegenargumenten: het kan zijn dat het een erfelijke kwestie is, het kan zijn dat kinderen in Afrika en Azië vroegtijdig aan leukemie overlijden zonder dat er ooit leukemie wordt vastgesteld. Maar aan de hand van de opkomst van de ALL-piek bij vierjarigen tijdens de `verwestersing' van Japan, en het moment van optreden van deze piek bij zwarte en witte kinderen in de VS, concludeert Greaves toch dat het waarschijnlijk een kwestie van latere blootstelling aan infecties is. Opgroeien in een groot, beetje viezig gezin, of vroeg naar de crèche, beschermt misschien wel tegen ALL.

De productie van B- en T-lymfocyten die gezamenlijk vele verschillende indringers herkennen is een kwestie van het aanbrengen van moleculaire variatie in de uiteinden van de antistof- en T-celreceptormoleculen. Die uiteinden hebben een hypervariabel deel waarmee de lymfocyten de indringers herkennen. Het hypervariabele eiwitdeel en het verdere constante eiwitdeel (C) van antistoffen ontstaat uit het gen IGH (IG staat voor immuunglobuline, H staat voor heavy, de lange eiwitketen) op chromosoom 14. Het hypervariabele deel van het gen ontstaat tijdens het rijpen van de B-lymfocyt door het at random uitkiezen en aan elkaar plakken van drie genfragmenten. De fragmenten worden gehaald uit drie pools van VH-, DH- en JH-genfragmenten die op het IGH-gen liggen. De koppeling wordt uitgevoerd door recombinase-enzymen RAG1 en RAG2. Die enzymen hebben inmiddels bij de immunologen de naam dat ze incidenteel groot leed veroorzaken.

KNIPPEN EN PLAKKEN

RAG1 en RAG2 koppelen pas genfragmenten als ze bepaalde nucleotidevolgorden van zeven en nog eens negen nucleotiden herkennen. Ieder DH-fragment heeft zo'n herkenningsvolgorde aan beide zijden, JH en VH hebben het ieder aan één kant. RAG1 en RAG2 knippen de herkenningssequenties af en koppelen de overgebleven genfragmenten. Het overblijvende herschikte IGH-gen kent daardoor in eerste instantie 7290 samenstellingen. Dat is kennelijk onvoldoende variëteit om de tijdens het leven noodzakelijke afweer te realiseren, want tijdens het koppelen is er een enzym (exonuclease) dat nucleotiden van de nog losse gen-eindjes weghapt. En een ander enzym (terminaal deoxynucleotidyltransferase, TdT) plakt er weer at random nucleotiden aan.

Als de lange IgH-keten af is moeten aan de korte poten van de Y nog twee eiwitketens worden gekoppeld om de antistof compleet te maken. De korte keten komt van een IG-gen (chromosoom 2) of IG-gen (op chromosoom 22). Het aantal combinatiemogelijkheden met de genfragmenten van lange en korte keten samen ligt al op een paar miljoen. Het tussentijdse willekeurig verwijderen en toevoegen van nucleotiden brengt het aantal theoretisch mogelijke combinaties op ongeveer 10. Dit geldt ook voor de herschikkingen van de T-celreceptorgenen.

Van Dongen: ``Het resultaat van het knip- en plakwerk in ieder antistof- of T-celreceptorgen moet wel steeds een veelvoud van drie nucleotiden zijn, om uiteindelijk een gen over te houden dat voor een eiwit codeert. Wordt het tussenstuk niet met een veelvoud van drie nucleotiden verlengd of verkort dan mislukt de actie en gaat de cel verloren. Ook als de knip- en plakenzymen toevallig een stopcodon maken ontstaat er geen functioneel eiwit. Daarom gaat het bij 70% van de recombinaties mis.''

Die ogenschijnlijke verkwisting weegt kennelijk ruimschoots op tegen het voordeel van de enorme variabiliteit in ons afweersysteem. Het aantal mogelijke combinaties is groter dan het aantal lymfocyten in ons lichaam. En onder die lymfocyten zijn nog al wat klonen van bestaande lymfocyten die in grote aantallen worden bijgemaakt op het moment dat een infectie een bedreiging vormt. Niet alle combinaties komen dus gelijktijdig in een mens voor.

Het gevaar van de recombinase-enzymen is dat ze in principe alle losse genfragmenten met een herkenningsvolgorde aan elkaar vast kunnen plakken. En erg nauwkeurig zijn ze daarbij niet. Een herkenningsvolgorde waarbij vijf van de zeven nucleotiden op de juiste plaats zitten, pakken ze ook aan.

BROKKEN DNA

Losse stukken DNA zijn geen zeldzaamheid. Door UV-licht, door bepaalde chemicaliën, of door toevallige buigingen in een chromosoom ontstaan er iedere dag in iedere cel wel breuken in de DNA-moleculen in de chromosomen. Er bestaat een gespecialiseerd DNA- reparatie-enzymsysteem dat de losse eindjes weer aan elkaar zet. Arriveren RAG1 en RAG2, de recombinase-enzymen die gespecialiseerd zijn in het knippen en plakken van de antistof- en T-celreceptorgenen, eerder bij zo'n toevallig brokstuk, dan plakken ze zo'n toevallige zwerver zonder verdere omhaal aan een brok van een antistof- of T-celreceptorgen, of ze plakken twee brokstukken van genen aan elkaar die helemaal niets met het afweersysteem te maken hebben.

``Meestal gaat dan toch niets mis'', zegt Van Dongen, ``want als je twee brokken van genen aan elkaar plakt levert dat zelden een functionerend gen op. Waar het fout gaat zie je vaak een foutieve transcriptiefactor of een foutief signaalmolecuul verschijnen die dan in te grote hoeveelheden worden aangemaakt.''

Een transcriptiefactor is een eiwit dat op een precies passende plaats op het DNA bindt en daarmee het aflezen van één of meer in de buurt gelegen genen stuurt. Van Dongen en zijn groep ontrafelden in 1993 de structuur van twee foutief gekoppelde SIL en TAL1 genen. Van Dongen: ``SIL is een gen op chromosoom 1 dat in T-lymfocyten altijd `aan' staat. Het TAL1-gen daarentegen wordt in T-lymfocyten bijna nooit gebruikt. Als het TAL1-gen echter per abuis aan de promotor van SIL wordt gekoppeld, waarbij het SIL zelf verdwijnt, dan staat het TAL1-gen opeens hard aan. Dit is waarschijnlijk de oorzaak van de leukemie, maar hoe de ziekte dan precies ontstaat is nog onbekend.''

De foutieve SIL-TAL1-genkoppeling komt voor in bijna een kwart van de patiënten met ALL die uitgaat van T-lymfocyten (wat overigens een zeldzamere vorm van ALL is). De basenvolgorde op de plaats waar de SIL- en TAL1-genen aan elkaar zijn geplakt maakt duidelijk dat de recombinase-enzymen er aan het werk zijn geweest. De uiteinden van de gekoppelde genen bezitten de herkenningssequenties voor de recombinase-enzymen en op de plaats van de koppeling zijn ook nucleotiden verdwenen of juist tussengevoegd, net zoals dat bij de koppeling van variabele fragmenten van de antistof- en T-celreceptorgenen gebeurt.

Van Dongen: ``Wij hebben de basenvolgorden van verschillende SIL-TAL1-genafwijkingen onderzocht om ze in de diagnostiek en bij de behandeling te kunnen gebruiken. Je neemt aan dat het tussengebied van gekoppelde genfragmenten, waarvan de basevolgorde toevallig wordt bepaald door de knip- en plakenzymen, uniek is voor een woekerende lymfocyt. Je bepaalt die sequentie, test of hij echt uniek is, en als dat zo is heb je een marker voor de leukemiecel op genniveau.''

Van de kinderen met ALL overleeft 75%. De overleving van volwassenen met ALL is veel lager, ongeveer 30 tot 40%. Aanvankelijk werd dit altijd geweten aan de hogere dosis chemotherapie die kinderen kunnen doorstaan en de grotere cytostaticumgevoeligheid van ALL-cellen op kinderleeftijd. Nu blijkt dat bij kinderen de leukemiecellen andere chromosoomafwijkingen hebben en rijper en agressiever zijn dan bij volwassenen. Sommige van de chromosoomafwijkingen bij kinderen geven betere vooruitzichten.

BIJSTELLEN

Ongeveer 22% van de kinderen met ALL heeft een translocatie van chromosoom 12 en 22, waarbij genfragmenten van TEL en AML1 zijn gekoppeld. Deze translocatie heeft een gunstige prognose. Een slechtere overlevingskans hebben de 6% kinderen waarbij een breuk in het MLL-gen is vastgesteld. Van Dongen houdt niet zo van dit soort voorspellingen: ``Welke genabnormaliteit je ook vindt, het blijft moeilijk om voor een individuele patiënt de therapie aan te passen op grond van de diagnose.''

Van Dongen en zijn onderzoekers hebben een methode ontwikkeld waarmee de therapie wel kan worden bijgesteld. Zijn groep profiteerde op een andere manier van de enorme variëteit in herschikte genen van lymfocyten. Kinderen met ALL ondergaan normaal gesproken twee jaar lang een reeks van chemotherapieën.

Van Dongen publiceerde eind vorig jaar de methode waarbij al na de eerste drie maanden chemotherapie kan worden voorspeld of een patiënt op den duur gevrijwaard blijft van de ziekte (The Lancet, 28 nov 1998). De onderzoekers onderscheiden patiëntengroepen die goed, middelmatig of slecht op de behandeling reageren. Dit bleek mogelijk doordat met de PCR-techniek de snelheid van afname van de leukemiecellen kan worden gevolgd.

Van Dongen: ``Je kunt beter voor iedere patiënt het effect van therapie karakteriseren en op grond daarvan de verdere therapie aanpassen, dan op grond van de diagnose een voorspelling doen. Wij zoeken voor de toepassing van de PCR-techniek bij iedere patiënt naar het koppelingsgebied tussen twee antistofgenfragmenten of twee T-celreceptorgenfragmenten. Dat is niet noodzakelijk het foutieve gebied waardoor de leukemie is ontstaan. Die ziekteveroorzakende translocaties zijn weliswaar ook bruikbaar, maar je vindt die bij minder dan de helft van de patiënten, terwijl het uiteraard de bedoeling is om bij alle patiënten de effectiviteit van de therapie te bepalen. De Lancet-publicatie heeft in Europa inmiddels veel losgemaakt. In Nederland worden alle kinderen met ALL volgens een nieuw en nog te onderzoeken protocol behandeld. Maar Duitsland en Italië starten binnenkort een behandelingsprotocol waarbij kinderen die volgens onze PCR-methode tot de goede responders behoren in de maanden daarna een lichtere chemotherapie ondergaan, zodat hun risico op blijvende schade door de chemotherapie afneemt. De kinderen met resterende leukemiecellen, dus de slechte responders, zullen een zwaardere behandeling krijgen.''

Taqman-PCR bij ALL

Met de polymerasekettingreactie (PCR, polymerase chain reaction) kan één uniek

DNA-fragment selectief worden vermenigvuldigd temidden van een poel van miljoenen

verschillende DNA-brokstukken. De Amerikaan Kary Mullis kreeg er in 1993 de Nobelprijs voor, een paar jaar nadat hij de PCR had ontwikkeld. De ontwikkeling van de

gentechnologie raakte door de PCR-techniek in een stroomversnelling.

Het principe is eenvoudig. Van een gen moeten twee klein stukjes volgorde van ieder een

twintigtal basen bekend zijn. Die volgorden moeten aan de beide uiteinden van het te

vermenigvuldigen fragment liggen. Die volgorden zijn de uitgangspunten, de primers.

Nu is het verder een kwestie van opwarmen, koelen en de juiste chemicaliën toevoegen.

Voor het leukemie-onderzoek wordt een oplossing met DNA uit beenmergcellen

opgewarmd tot 94°C, wat ervoor zorgt dat de DNA-dubbelstrengen van elkaar loslaten. Nu worden de primers in overmaat toegevoegd. Bij afkoelen tot ongeveer 60 graden

hebben die primers zich gehecht aan het te vermenigvuldigen DNA-fragment. In dit geval is het DNA-fragment uniek voor de leukemiecellen van één patiënt. Een

toegevoegd enzym (polymerase) is gespecialiseerd in de aanmaak van dubbelstrengs-DNA op basis van de mal van een enkele DNA-streng, beginnend bij de primers. Vanaf de

primers synthetiseert polymerase een stuk dubbelstrengs-DNA.

Door op tijd opnieuw te verwarmen stopt dat proces en laten die nieuwe dubbele strengen weer los. Bij afkoelen worden aan de strengen weer primers gebonden en doet polymerase opnieuw zijn werk. Na één koelcyclus zijn er twee kopieën, na twee cycli zijn er vier en na 30 cycli zijn er vele miljoenen DNA-fragmenten.

Bij kwantitieve Taqman-PCR wordt naast de twee primers nog een DNA-probe gebruikt. Die bindt op het DNA waar het polymerase langskomt bij de aanmaak van de kopie-keten. Aan de probe zijn twee labels gebonden. Een van die twee is in principe een fluorescerend molecuul (de reporter) dat licht uitstraalt als er met een laser op wordt geschenen.

Zolang hij aan de probe vast zit wordt hij echter in zijn fluorescentie gehinderd door het aan dezelfde probe gebonden tweede label (de quencher). Zodra polymerase bij de probe arriveert laat de reporter los van de probe. Hij is zijn quencher kwijt en na de volgende laserpuls straalt hij licht uit. Dat licht wordt gemeten. De hoeveelheid licht tijdens een PCR-stap

is dus een maat voor de hoeveelheid van het gewenste DNA-product in het meetvaatje.

Er zijn (prijzige) machines die de Taqman-PCR geautomatiseerd uitvoeren.

Op het lab van Van Dongen worden primers en probes gebruikt die uniek zijn voor de

leukemiecellen van individuele patiënten. De Taqman-PCR-machine rekent uit hoeveel leukemiecellen er zitten in het beenmerg van een patiënt van wie het DNA in de machine werd gestopt.