Kookboek voor een cel; EMBRYONALE STAMCEL IS GEWILD VOOR HET KWEKEN VAN ORGANEN

Voor het maken van genetisch gemanipuleerde muizen is de embryonale stamcel een absolute noodzaak. En nu willen onderzoekers hem ook gaan gebruiken om menselijke organen te kweken.

VOORZICHTIG ZET dr. Christine Mummery de plastic plaat onder de microscoop. Ze wijst op de zes putjes, gevuld met een rosékleurige vloeistof. “Daar zitten ze in”, zegt de van oorsprong Britse ontwikkelingsbiologe en ze kijkt door beide oculairen. En terwijl ze de kruk vrijmaakt: “Kijk. In het midden van het beeld.” Op m'n netvlies verschijnt een soort kikkerdril drijvend in een vloeistof, doorschenen met een zacht groen licht. Mummery, verbonden aan het Hubrecht Laboratorium (het Nederlands Instituut voor Ontwikkelingsbiologie) in Utrecht: “Dat zijn eilandjes van embryonale stamcellen. Die zijn voor ons goud waard. Uit die cellen kun je spierweefsel kweken. Of hersencellen, of bloedcellen. Dat is het unieke van de embryonale stamcel, je kunt er alle kanten mee op.”

De belangstelling voor de embryonale stamcel stijgt de laatste tijd, onder andere vanwege het chronisch tekort aan organen voor transplantatie. Om dat tekort aan te vullen wordt er gezocht naar alternatieven. Een daarvan is xenotransplantatie, het gebruik van organen van een ander zoogdier. Genetisch gemanipuleerde varkens zijn favoriet. De organen van de gemanipuleerde varkens dragen menselijke eiwitten op hun buitenkant zodat ze na transplantatie minder snel zullen worden afgestoten. Maar het onderzoek staat nog in de kinderschoenen en stuit op nogal wat technische problemen.

Het kweken van menselijke organen is een ander alternatief. Je begint met een embryonale stamcel, voegt daar de juiste stoffen aan toe die deling en de juiste differentiatie bevorderen, en de cel gaat zich delen en ontwikkelen totdat zich het gewenste weefsel heeft gevormd. Mummery: “De embryonale stamcel is de enige cel waarmee je in principe alle weefsels kunt maken. Die cel is nog volkomen ongeschoold.”

Mummery hoopt binnenkort aan de slag te kunnen met embryonale stamcellen uit menselijke pre-embryo's (zie kader). Misschien dat ze er dan in slaagt om een hart te kweken, net zoals een aantal Japanse onderzoekers van de University of Tokyo twee jaar geleden deed. Ze speelden dat klaar met embryonale stamcellen van een salamander (Cynops pyrrogaster) waaruit in twee weken tijd kloppende hartjes groeiden. De organen vertoonden een normale hartslag die veranderde met het stijgen en dalen van de temperatuur. Vorig jaar maakten dezelfde onderzoekers bekend dat ze ook nierweefsel konden kweken. Ze gebruikten daarvoor embryonale stamcellen van dezelfde soort salamander, maar dit keer in een andere vloeistof geplaatst. Er ontwikkelden zich nierbuisjes. De Japanners beweren dat ze inmiddels ook oog- en oorweefsel kunnen kweken.

Maar er zitten nog veel haken en ogen aan dit onderzoek. De Japanners hadden veel uitvallers. Slechts een klein percentage van de stamcellen ontwikkelde zich tot een kloppend hart. Mummery: “We hebben nog niet de kennis om de vorming van een orgaan volledig te controleren. Veel organen bevatten verschillende soorten cellen en het is erg lastig om de ontwikkeling daarvan precies te reguleren. En als zich al zo'n orgaan vormt dan is het maar de vraag of het precies zo functioneert als zijn echte evenbeeld.” Mummery denkt eerder aan het kweken van weefsels, zoals spier- of hersenweefsel. “Dan praat je over één celtype, dat zal makkelijker te realiseren zijn. Denk aan menselijke zenuwcellen die dopamine produceren. Als je die kunt kweken dan heb je een goed alternatief voor Parkinson-patiënten. Dan ben je ook af van dat akelige gedoe met menselijke embryo's. Amerikaanse patiënten reizen nu naar China waar vrouwen hun twintig weken oude foetus voor wat geld laten aborteren. Chirurgen halen de gewenste hersencellen uit de foetus en transplanteren die naar de patiënt. Daar zou je graag een alternatief voor hebben.”

INNER CELL MASS

Embryonale stamcellen vind je alleen in embryo's, in de zogeheten inner cell mass. Als een eicel bevrucht is door een zaadcel gaat de ontstane zygote zich delen, een proces dat voor zoogdieren goed in kaart is gebracht. Aanvankelijk verdubbelt het aantal cellen. In een zestiencellig embryo gaan de cellen de taken verdelen. In het midden liggen een of twee cellen die in de daaropvolgende delingen de inner cell mass vormen. Hieruit ontwikkelt zich de foetus. Om de inner cell mass heen liggen cellen die later het vruchtvlies, de buitenste laag van de placenta, gaan vormen. Als het embryo uit 64 cellen bestaat (het blastocyst-stadium), is de inner cell mass volledig gescheiden van het omliggende weefsel. In deze fase zijn sommige cellen in de inner cell mass nog totipotent, ze kunnen nog alle weefsels vormen. Bij de muis zijn er dan ongeveer vijf dagen verstreken sinds de bevruchting. Snel daarna verliezen de stamcellen hun bijzondere capaciteit. Ze beginnen aan hun differentiatie. Beïnvloed door hun omgeving worden vele genen uitgeschakeld en andere aangeschakeld, waardoor de ene stamcel niercel wordt, de andere eicel. Dit onherroepelijke proces zorgt voor de onmisbare taakverdeling binnen een meercellig organisme. Is een cel gedifferentieerd dan verliest hij zijn totipotente karakter en kan hij in principe niet meer in die oude staat terugkeren. Maar met schaap Dolly bewezen onderzoekers dat een gedifferentieerde cel door manipulatie weer totipotent kan worden.

In sommige weefsels blijf je stamcellen aantreffen, maar die zijn niet totipotent. In het beenmerg zitten bijvoorbeeld stamcellen die de populatie bloedcellen voortdurend verversen. Zo maakt de mens dagelijks honderd miljard rode bloedcellen aan om de versleten exemplaren, die een levensduur van ongeveer 120 dagen hebben, te vervangen. Een stamcel in het beenmerg kan zich nog wel differentiëren tot een tiental verschillende typen bloedcellen, maar hij kan geen darmcel of botcel meer worden. Dezelfde beperking geldt voor stamcellen in de huid en in de darm. Totipotentie is aan de embryonale stamcel voorbehouden. Mummery: “Je kunt natuurlijk zeggen, waarom gebruik je die latere stamcellen niet. Haal die uit een volwassene en kweek daaruit het gewenste weefsel. Maar van veel weefsels, zoals de hersenen en de hartspieren, bestaan in een volwassen persoon helemaal geen stamcellen. Die verdwijnen tijdens de ontwikkeling. Zenuw- en spiercellen worden niet meer vernieuwd.”

De belangstelling voor de embryonale stamcel kwam zo'n dertig jaar geleden op, vanuit het kankeronderzoek. Oncologen verbaasden zich al jaren over de groteske samenstelling van teratocarcinomen. In deze tumoren bevindt zich een onsamenhangende mix van bloedcellen, bindweefsel, botcellen en zelfs haren of tanden. In het Academisch Ziekenhuis Groningen werd dertien jaar geleden een jongetje geboren met aan zijn onderlijf een teratocarcinoom waarin zich twee voetjes hadden ontwikkeld. De tumor werd operatief verwijderd, de jongen verkeert sindsdien in goede gezondheid.

MUIZENEXPERIMENTEN

Bij nader onderzoek ontdekten oncologen dat sommige cellen in zo'n teratocarcinoom duidelijke overeenkomsten vertonen met embryonale stamcellen. Muizenexperimenten maken dat duidelijk. Je kunt een normaal muizenembryo van 64 cellen in een andere muis plaatsen, op een plek waar het niet hoort, bijvoorbeeld onder de nieren of in de buikholte. Omdat het embryo niet de juiste signalen uit zijn omgeving ontvangt, ontwikkelt het zich niet goed. Er kan dan een teratocarcinoom ontstaan. Haal je een stamcel uit zo'n tumor en breng je die met een injectienaald in een ander 64-cellig embryo dat in een baarmoeder groeit, dan ontstaat er een gewone muis, zonder carcinoom. De ingebrachte tumorcel volgt de ontwikkeling alsof hij onderdeel van het embryo is. Mummery: “Zo ontdekte men dat de ontwikkeling van de stamcel helemaal gestuurd wordt door omgevingsfactoren.”

Meteen kwam de wens op om stamcellen in kweek te brengen. Kun je ze kweken dan kun je ze bestuderen. Misschien leer je daardoor meer over het ontstaan van sommige tumoren en kun je manieren bedenken om dat proces tegen te gaan. Dat was althans de gedachte.

In 1981 slaagden de Britten M. Evans en M. Kaufman van de University of Cambridge erin om totipotente cellen van de muis te kweken. Een half jaar later lukte Gail Martin van de University of California in San Fransisco hetzelfde. Binnen de kortste keren circuleerden er standaardrecepten om dergelijke stamcellen van de muis in kweek te brengen. “Toch blijft het een hele toer”, zegt dr. P. Krimpenfort van het Nederlands Kanker Instituut (NKI) in Amsterdam. Krimpenfort gebruikt zelf embryonale stamcellen, maar niet voor het oorspronkelijke doel - het bestuderen van de biologie van de totipotente cel. “Wij gebruiken ze voor het maken van knock out-muizen. Dat zijn muizen waarbij een bepaald gen is uitgeschakeld”, zegt Krimpenfort en hij gooit een dik boek op tafel. Manipulating the mouse embryo; a laboratory manual staat er op de omslag. Krimpenfort: “Zie het als ons kookboek.”

HANDEN WASSEN

Krimpenfort stelt voor om de knock outs in het dierenlab te bekijken. Handen wassen met zeep, afdrogen en nog eens overgieten met een desinfecterende vloeistof. Dan volgt een drempel van ongeveer 15 centimeter hoog. “Terwijl je eroverheen stapt moet je deze plastic zakken over je schoenen trekken. Voor de hygiëne”, zegt Krimpenfort. Daarna nog een groene chirurgenjas aan en de toegang tot het laboratorium is toegestaan. Krimpenfort loopt langs een paar deuren tot er een is waarop met zwarte stift Paul staat geschreven. “Hier zitten mijn muizen”, zegt Krimpenfort en hij stapt de kamer binnen. Aan de muren hangen schappen waarop tientallen plastic bakken. In sommige bakken liggen naakte, pasgeboren jongen dicht tegen elkaar gekropen. In andere volwassen dieren.

“Knock out-muizen gebruiken we om de functies van genen te achterhalen. We worden overspoeld met de DNA-codes van genen, maar van lang niet alle genen kennen we de bijbehorende functie.”, aldus Krimpenfort. “In een knock out wordt het nieuw-gevonden gen uitgeschakeld. Dat gebeurt met een speciale techniek die uitgaat van een cellijn.”

Om zo'n cellijn te krijgen isoleer je uit een muizenembryo eerst de inner cell mass, daarvan week je de cellen los en die doe je vervolgens allemaal afzonderlijk in een bakje met kweekvloeistof. Daarin zitten stoffen die de deling van de cel bevorderen, maar de differentiatie tegengaan. De bakjes waarin embryonale stamcellen zitten pik je er zo uit, want die cellen groeien als kool. Ze vormen typische eilandjes. Bovendien kun je de cellen goed herkennen omdat ze een enorme celkern hebben en maar heel weinig celplasma.

Krimpenfort: “Van zo'n eilandje kun je de cellen dan weer losweken. In de stamcellen proberen we een gewenst gen uit te schakelen via de knock-out techniek. Die is helemaal toegespitst op de stamcel, bij andere cellen is de techniek minder efficiënt. De cellen waarbij de ingreep lukt, kunnen wevervolgens selecteren.”

Niet bekend

Een groepje knock out-stamcellen wordt vervolgens in een 64-cellige embryo geïnjecteerd en dat embryo wordt teruggeplaatst in een 'draagmuis'. Na drie weken worden er per zwangere muis gemiddeld vier muizen geboren waarvan de weefsels een dubbele afkomst hebben. Sommige cellen stammen af van het oorspronkelijke embryo, andere zijn voortgekomen uit de knock out-stamcel. Ook voor de zaadcellen geldt dat. Als de muis geslachtsrijp is en een wijfje bevrucht ontstaan de gewenste nakomelingen alleen als de bevruchting met een 'knock-out zaadcel' plaats vond. Elke cel in zo'n muizenlijf draagt dan het knock-out gen.

Het in Texas gevestigde bedrijf Lexicon Genetics maakte vier maanden geleden bekend dat het een lopende-bandtechniek heeft ontwikkeld om knock out-muizen te maken (Nature, 9 april 1998). Voorheen duurde het enkele maanden om knock-out stamcellen te maken en die in kweek te brengen. Lexicon beweert dat ze nu 1000 knock-out cellijnen per week kan maken. Hun diepvriezers moeten inmiddels vol liggen met duizenden stamcellen waarbij een of ander gen is uitgeschakeld. Het Merck Genome Research Institute en het Deense bedrijf Novo Nordisk hebben onlangs grote contracten gesloten met Lexicon Genetics voor de aanlevering van knock out-cellijnen.

Inmiddels is de knock out-techniek verfijnd. Het gen van interesse werkt in eerste instantie gewoon, met de muis is niks aan de hand. Maar het gen kan in principe op ieder ogenblik en in elk gewenst orgaan worden uitgeschakeld. Krimpenfort gebruikt deze techniek: “Omdat we daarmee het ontstaan van kanker veel beter kunnen nabootsen, want daarbij gaat het ook vaak om genen die tijdens het leven opeens wegvallen in sommige delen van het lichaam.”

VITAMINE A

De nu toenemende belangstelling voor embryonale stamcellen van de mens doet nogal sci-fi aan. Mummery geeft toe dat het kweken van menselijke weefsels, of zelfs organen, nog toekomstmuziek is. “We weten niet precies hoe we een muizenstamcel moeten laten uitgroeien tot alleen maar spierweefsel, of zenuwweefsel”, zegt de ontwikkelingsbiologe. “Van een aantal stoffen weten we wel dat ze de ontwikkeling in een bepaalde richting sturen. Als je vitamine A toevoegt dan heeft de stamcel de tendens om zenuwweefsel te vormen, met een andere stof gaat hij juist de kant op van spierweefsel. Maar over fijnregulatie bij de muis weten we nog weinig, laat staan bij de mens.”

Ook het opsporen en kweken van embryonale stamcellen blijft lastig. Voor muizen is het weliswaar routine, bij salamanders lijkt het ook aardig te lukken, maar voor andere dieren zijn embryonale stamcellen nog niet gevonden. Bij het rund lijkt het onlangs gelukt (Nature Biotechnology, juli). “Maar het is niet zeker of het werkelijk om stamcellen gaat. De auteurs zeggen zelf ook dat ze daar niet zeker van zijn. Ze noemen het stamcel-achtige cellen.”

Ondanks alle twijfels wil Mummery graag aan de slag met menselijke embryonale stamcellen. “We willen ze ook gebruiken om het vroege proces van differentiatie te bestuderen. Ook bij het onderzoek naar de toxiciteit van stoffen, bijvoorbeeld nieuwe geneesmiddelen, kunnen de stamcellen van pas komen. Je hebt dan minder proefdieren nodig.”

Stamcellen uit pre-embryo's

Onderzoekers van het Hubrecht Laboratorium in Utrecht willen onderzoek gaan doen aan embryonale stamcellen van de mens. Dit zijn cellen die alleen in het vroege embryo (tot het 64-cellig stadium) voorkomen en nog de potentie bezitten om tot alle mogelijke weefsels uit te groeien. De Utrechtse ontwikkelingsbiologen willen de stamcellen gaan gebruiken voor het kweken van menselijke weefsels. Als bron dienen overtollige pre-embryo's die na in vitro fertilisatie (IVF) zijn overgebleven. “We hebben al contacten met de IVF-kliniek van het Academisch Ziekenhuis hier in Utrecht. Daar zijn ze in principe bereid om de pre-embryo's aan te leveren, mits de donors daarin toestemmen”, zegt ontwikkelingsbiologe dr. Christine Mummery.

Op het moment rust er nog een verbod op het gebruik van deze pre-embryo's voor wetenschappelijke en therapeutische doeleinden. Daar komt binnenkort misschien verandering in. In het wetsvoorstel inzake handelingen met menselijke geslachtscellen en embryo's wordt voorgesteld om gebruik van deze embryo's toch toe te staan voor onderzoek dat is gericht op de 'verbetering van kennis inzake (on)vruchtbaarheid, kunstmatige voortplanting en erfelijke of aangeboren afwijkingen'.

De Gezondheidsraad vraagt zich echter af of deze opsomming niet teveel uitsluit. Embryonale stamcellen zouden ook van nut zijn voor het bestuderen van vroege embryonale ontwikkelingsprocessen. En ze zouden gebruikt kunnen worden voor het kweken van menselijke weefsels. De Gezondheidsraad attendeerde de minister van Volksgezondheid hierop in een vorig jaar geschreven advies ('Onderzoek met embryonale stamcellen'). De raad stelt daarin voor om het wetsvoorstel aan te passen zodat ook ander onderzoek met een 'zwaarwegend gezondheidsbelang' is toegestaan. Over een aantal weken zal de minister een besluit nemen over het wetsvoorstel.

Mummery: “In Australië en Amerika doen ze dergelijk onderzoek al. Daar zijn onderzoekers er al in geslaagd om cellen uit humane pre-embryo's in kweek te brengen, hoewel nog niet zeker is of het hier om embryonale stamcellen gaat. We corresponderen wel voortdurend met die groepen zodat we de stand van zaken bijhouden, maar het liefst zouden we het onderzoek zelf doen.”

    • Marcel aan de Brugh