De klok is overal; MOLECULAIR MECHANISME VAN BIOLOGISCH RITME ONTLEED

Alles op tijd. De biologische klok regelt de slaap en de zoektocht naar voedsel. De moleculaire mechanismen van deze ijzeren regelmaat worden langzaam blootgelegd.

HET LEVEN HEEFT zijn cycli. De veldmuis verlaat zijn hol als het donker is en keert vlak voor de dageraad terug. De zeekrab Sesarma reticulatum komt bij eb uit zijn zanderige onderkomen gekropen en zoekt over de drooggevallen zeebodem naar voedsel. Als het tij opkomt verdwijnt hij weer onder het zand. In augustus komt de slobeend uit Skandinavië ons land binnenvliegen. Begin mei keert hij terug naar het hoge noorden.

“Die cycli worden in de hand gehouden door de biologische klok. De klok controleert ook de lichaamstemperatuur en de afgifte van hormonen”, zegt dr. Joke Meijer. Ze is verbonden aan het Laboratorium voor Fysiologie van het Leids Universitair Medisch Centrum en bestudeert de invloed van licht op het functioneren van de biologische klok bij ratten. Meijer onderstreept hoeveel er de afgelopen jaren bekend is geworden over de werking van de biologische klok. “We beginnen te begrijpen hoe hij tikt. Het mechanisme is voor een belangrijk deel in kaart gebracht, tot op moleculair niveau. We weten ook hoe de klok kan worden bijgesteld. Licht speelt daarbij een essentiële rol.” Vorig jaar beleefde het onderzoek een doorbraak. Een aantal 'klok-genen' werd opgespoord. Zij liggen aan de basis van de biologische klok, ze zorgen ervoor dat hij met een ijzeren regelmaat blijft tikken. Science achtte de vondst erg belangrijk: hij belandde op plaats vier in de jaarlijkse top-tien-lijst van belangrijke wetenschappelijke ontdekkingen.

Twee weken geleden was het weer raak. Het blad Cell berichtte over nieuw ontdekte klok-genen bij de fruitvlieg, Science publiceerde over soortgelijke genen bij de muis. 'We gluren nu naar het hart van de klok', schreef de Amerikaanse onderzoeker Jay Dunlap in een commentaar. Er zijn inmiddels klok-genen bekend van de schimmel Neurospora, van de fruitvlieg, van de muis en de mens. En wat blijkt? De betrokken genen lijken niet altijd op elkaar, maar het mechanisme van de klok is zo goed als identiek. 'Same clock, different works', schreef de Franse klok-onderzoeker Paolo Sassone-Corsi. Het mechanisme van de klok is hetzelfde, hoe de radertjes eruit zien doet er blijkbaar niet zoveel toe.

ZACHT GESIS

De biologische klok kent verscheidene ritmes. Het ene duurt een dag (het slaap-waakritme van de mens), het andere past zich aan de getijden aan en komt vooral voor bij zeedieren. Zo komt de alg Hantzchia virgata pas bij eb (dus in een cyclus van 12 uur en 25 minuten) onder het zand vandaan. Blootgesteld aan het zonlicht start deze eencellige zijn fotosynthese, een proces waarmee hij energie opslaat. De algen verraden hun aanwezigheid vaak door een zacht gesis. Tijdens de fotosynthese persen ze zuurstofbelletjes via kleine poriën naar buiten. Als ze dat gericht doen, bewegen ze zich voort en kunnen ze op zoek naar een plek waar ze veel zonlicht vangen. Vlak voordat het tij op komt zetten, verdwijnt de alg weer onder het zand.

Dan zijn er ook nog de jaarlijke cycli, bijvoorbeeld de winterslaap van eekhoorn en beer. Of de trek van zalm en kanoetstrandloper. Al deze cycli lopen op commando van de biologische klok. “Het is een aanpassing van de evolutie, een overlevingsstrategie”, aldus Meijer. “De klok is een instrument waarmee organismen hun fysiologische processen en hun gedrag kunnen afstemmen op een veranderende omgeving. Verstoor je de klok, dan neemt je overlevingskans af. Voor de westerse mens geldt dat natuurlijk niet meer. Hij heeft die overlevingsstrategie niet meer nodig, want er is genoeg voedsel en een natuurlijke vijand ontbreekt.”

De meest bestudeerde cyclus is het circadiane ritme (circa betekent ongeveer, dies staat voor dag). Ons slaap-waakritme is daarvan een voorbeeld. De klok die hiervoor verantwoordelijk is, de circadiane klok of pacemaker, kent een omlooptijd van om en nabij de 24 uur. Maar hij loopt niet helemaal synchroon met de dag. De circadiane klok van de mens kent een ritme van gemiddeld 24 uur en 48 minuten, dat van de alg Gonyaulax polyhedra duurt 22 uur en 52 minuten. Daarom moet de interne klok iedere dag ietsje bijgesteld worden. Dat gebeurt door een zogeheten Zeitgeber. Bijvoorbeeld daglicht. Ook temperatuur of zoutgehalte kan die functie vervullen.

EXTRA INSPANNING

Zonder Zeitgeber wordt de klok niet bijgesteld en houdt hij zich aan zijn eigen interne ritme. De klok belandt dan in een free run, hij gaat vrij lopen. Dat merkte de Franse speleoloog Michel Siffre begin jaren zestig. Met een aantal companen verdween hij wel eens voor een aantal weken, of zelfs maanden, onder de grond. De avonturiers wilden weten of ze zich in een benauwende, pikdonkere omgeving anders gingen gedragen. Dat viel mee. Maar hun tijdsbesef werd danig door elkaar geschud. Toen ze weer boven kwamen kregen ze volop complimenten. Ze hadden het lang weten vol te houden. Vier weken. Siffre was stomverbaasd. Vier weken? Volgens hun eigen slaap-waakcyclus waren ze net aan de derde week begonnen.

“Zonder licht ontspoort onze circadiane klok”, zegt Meijer. “Bij gewervelde dieren, zoals de rat, komt het licht via het oog binnen. Zenuwcellen worden door de invallende fotonen geprikkeld en geven een signaal door aan de optische zenuw die vervolgens de hersenen inloopt. Al snel krijgt die zenuw een paar aftakkingen naar een gebiedje van ongeveer 0,1 mm groot. Dat gebied heet de suprachiasmatische kern. De rat heeft twee van die gebieden, net als de meeste andere zoogdieren. De ene zit in de linker hersenhelft, de ander in de rechter. En in die kernen zit de circadiane klok.”

Uit zo'n suprachiasmatische nucleus (SCN) vertrekken weer allerlei zenuwbanen naar andere hersengebieden. Bij de rat zijn er dat meer dan 50. En die staan weer in verbinding met andere hersengebieden. De SCN heeft dus, direct of indirect, invloed op talloze hersengebieden en dus potentieel op ontzettend veel lichaamsprocessen. Bij de mens zorgt de SCN er bijvoorbeeld voor dat de bijnieren in de vroege ochtend glucocorticoïden gaan aanmaken. Deze hormonen stimuleren onder andere de lever tot de aanmaak van enzymen en die zorgen op hun beurt weer voor de aanmaak van suiker. Vroeg in de ochtend begint het lichaam dus energie te mobiliseren voor onze spieren en hersenen.

De klok zorgt er ook voor dat hoogzwangere vrouwen vooral in de vroege ochtend bevallen, zo tussen vier en negen. Het spierweefsel van de baarmoeder is tussen middernacht en vijf uur 's ochtends namelijk het gevoeligst voor het hormoon oxytocine. In dat tijdraam trekken de spieren zich dus optimaal samen, wat gunstig is bij een natuurlijke bevalling.

Voor de onderlinge afstelling van lichaamsprocessen is de klok waarschijnlijk heel belangrijk. In het verlengde hiervan kunnen circadiane ritmen een rol gaan spelen in de kliniek. Bijvoorbeeld bij de behandeling van kanker. Zo beschreven Franse onderzoekers vorig jaar in The Lancet een onderzoek aan twee groepen patiënten met dikke-darmkanker (6 sept. 1997). De ene groep kreeg continue chemotherapie, de andere groep kreeg de geneesmiddelen om vier uur 's middags en 's nachts toegediend. In de laatste groep had de behandeling duidelijk meer effect en de toxische bijwerkingen waren beduidend minder.

Over de SCN van de mens is nog weinig bekend. Het is niet duidelijk met welek andere hersengebieden het contact. “Wat we wel weten is dat de circadiane klok van dag- en nachtdieren hetzelfde werkt. Overdag is hij actief, 's nachts inactief”, aldus Meijer. “Maar het effect bij mens en rat is tegengesteld. Een actieve klok zorgt ervoor dat de mens wakker wordt en gaat werken, terwijl hij er bij de rat juist voor zorgt dat het dier gaat rusten.”

De SCN van de rat bestaat uit 10.000 zenuwcellen. Een onbekend aantal daarvan functioneert ritmisch: de klokcellen. Samen zorgen zij voor het uiteindelijke schommelende signaal dat de SCN uitzendt. Elk van die klokcellen tikt in een eigen tempo, zo blijkt uit onderzoek van Steven Reppert en medewerkers van Harvard Medical School in Boston. De onderzoekers isoleerden klokcellen uit de SCN van hamsters en kweekten die in het laboratorium verder. Ze bekeken in totaal 38 klokcellen. Het circadiane ritme in de ene cel duurde 20 uur en 25 minuten, in de andere was het 25 uur. Het gemiddelde lag bij 23 uur en 25 minuten. Volgens de Amerikanen beïnvloeden en synchroniseren de individuele klokcellen elkaar. Het systeem kan zich juist daardoor makkelijk aanpassen aan veranderingen in dag- en nachtlengte. Voor een enkele cel zou dat veel moeilijker zijn.

Klokcellen komen trouwens niet alleen in de SCN voor. De groep van Ueli Schibler, van de Unversité de Genève, onderzocht bindweefselcellen en tumorcellen uit de lever. De Zwitsers ontdekten dat er in die cellen klok-genen worden afgelezen, volgens een circadiane ritmiek (Cell, 12 juni 1998). Ze suggereren dat de genen niet alleen een rol spelen als onderdeel van de circadiane klok, maar ook bij een proces als celdeling.

Die integratie van functies komt het duidelijkst naar voren bij eencelligen, zoals de alg Gonyaulax polyhedra. De alg leeft onder andere voor de kust van San Francisco. Onderzoekers van het Scripps Institution of Oceanography in La Jolla verbaasden zich over het blauwe schijnsel rondom de pijlers van een nabijgelegen oude pier. Het licht bleek afkomstig van Gonyaulax die zich daar met miljoenen verzameld had. De eencellige gloeit vooral 's nachts, volgens een streng ritme. Maar hij kent nog 12 andere ritmes. Fotosynthese, celdeling en bijvoorbeeld verticale migratie kennen elk hun eigen cyclus. En dat allemaal in een alg die niet groter is dan een twintigste millimeter.

Een ander opmerkelijk voorbeeld is dat van de eencellige alg Acetabularia, die overigens vooral beroemd is om zijn vermogen zich opblazen tot een verbluffende lengte van 13 centimeter _ de alg is normaal ongeveer eenhonderdste millimeter groot. Als de celkern uit zo'n alg wordt verwijderd, met daarin dus de erfelijke informatie voor onder andere de biologische klok, houdt het organisme zijn ritmiek. Een maand lang! En als je een alg opdeelt in fragmenten van 10 millimeter blijken zich in elk stuk ritmische processen af te spelen. De klok is zo'n beetje overal, concludeerde John Aldrich van het Trinity College ooit.

DOORBRAAK

Het genetisch onderzoek aan de biologische klok beleefde vorig jaar een doorbraak. Joe Takahashi en medewerkers ontdekten het eerste klok-gen van een zoogdier. Takahashi had er vijf jaar naar gezocht. “Je kunt mijn opluchting begrijpen toen we het gen eindelijk in handen hadden”, zegt de Amerikaanse geneticus desgevraagd.

Takahashi, verbonden aan het Science and Technology Center for Biological Timing van de Northwestern University in Evanston (Illinois), koos muizen voor zijn onderzoek. Hij injecteerde mannelijke dieren met de stof N-ethyl-N-nitrosourea. Dat veroorzaakte mutaties in onder andere hun spermacellen. Daarna liet hij de mannetjes paren met vrouwelijke muizen. De 304 nakomelingen werden daarna onderzocht op hun circadiane ritme. De meeste muizen waren in dit opzicht normaal. Ze hadden een cyclus van ongeveer 23 uur en 40 minuten. Maar bij één muis duurde de cyclus ruim een uur langer. Takahashi: “Je kunt dat ritme makkelijk aflezen aan hun activiteit. Zodra het donker wordt, kruipen ze in de tredmolen en beginnen ze te lopen. Je meet de aanvang van die activiteit en dat doe je een aantal dagen achter elkaar.”

Takahashi en zijn medewerkers onderzochten daarop het erfelijk materiaal van de gemuteerde muis. Via DNA-technieken konden ze het gemuteerde gen lokaliseren op chromosoom vijf. Langzaam maar zeker lukte het hun om steeds verder in te zoomen op het gen. Vorig jaar, op 16 mei, was het zover. Cell publiceerde de vondst van het zo lang gezochte gen dat, hoe kan het anders, de naam clock meekreeg. 'Let's have a party', schreef het vakblad zichtbaar verheugd in een commentaar.

Het genetisch beeld van de circadiane klok begon snel duidelijker te worden. Vlak voor de ontdekking van Takahashi had Jay Dunlap van Dartmouth Medical School in Hanover (New Hampshire) twee klok-genen bij de schimmel Neurospora opgespoord: wc-1 en wc-2 (wc staat voor white collar). In december werd een menselijk klok-gen gevonden (rigui, genoemd naar een oude Chinese zonnewijzer). En twee weken geleden meldden Cell en Science de vondst van weer een paar nieuwe klok-genen, van respectievelijk de fruitvlieg en de muis. Van de schimmel Neurospora zijn nu drie klok-genen bekend, van de fruitvlieg vier, de muis vijf. Het beeld dat hieruit naar voren komt is voor alle drie de organismen hetzelfde, de klok oscilleert op basis van een negatief terugkoppelingssysteem.

De groep van Jay Dunlap zocht uit hoe dat systeem bij de schimmel werkt. Ze richtten zich in eerste instantie op het frq-gen. Het frq-gen en zijn product, het FRQ-eiwit, spelen een soort duw- en trekspelletje met elkaar. In de loop van de ochtend gaat de schimmel het frq-gen in toenemende mate aflezen. In de celkern wordt een kopie van dit stukje DNA gemaakt. De kopie, het boodschapper RNA (of mRNA), verlaat de kern en komt in het cytoplasma terecht. Daar wordt de informatie op het mRNA vertaald in een eiwit, FRQ in dit geval. De hoeveelheid mRNA bereikt aan het begin van de middag zijn hoogste concentratie. Daarna neemt het af om in de vroege avond op zijn dieptepunt te belanden. In de loop van de ochtend komt die concentratie weer langzaam omhoog.

BLOKKEREN

De afname van mRNA is te wijten aan het FRQ-eiwit. Dat blokkeert op de een of andere manier zijn eigen transcriptie (het aflezen van een gen). Hoe meer eiwit, hoe sterker de transcriptie van het frq-gen wordt geblokkeerd. Kortom, in de loop van de ochtend ontstaat er steeds meer mRNA, dus ook meer eiwit. Door de toenemende concentratie FRQ-eiwit wordt de transcriptie van het frq-gen steeds sterker geblokkeerd. En daardoor komt er weer minder mRNA en uiteindelijk ook weer minder eiwit. Die schommeling gaat maar door, dag in, dag uit.

Dunlap had echter snel in de gaten dat er meer moest zijn. Want het FRQ-eiwit zou zijn eigen transcriptie uiteindelijk helemaal stil kunnen leggen. Maar dat gebeurt niet. De schimmel begint 's ochtends gewoon weer het frq-gen af te lezen. Hoe kan dat? De recent ontdekte genen, wc-1 en wc-2, brengen de uitkomst. Deze genen worden voortdurend afgelezen. En hun producten, de eiwitten WC-1 en WC-2, lezen het frq-gen af. Het FRQ-eiwit blokkeert dit systeem, maar nooit volledig. Er zijn dus positieve elementen (wc-1 en wc-2) en negatieve elementen (het FRQ-eiwit) die voortdurend op elkaar in werken en ervoor zorgen dat er een oscillerend systeem ontstaat. De signalen die uit dat systeem voortkomen kunnen weer andere processen aansturen. Wat voor de schimmel geldt, lijkt ook op te gaan voor de fruitvlieg en de muis.

Zijn hiermee de moleculen van de circadiane klok blootgelegd? 'Nee', schreef Dunlap twee weken geleden in Science. Er spelen nog andere moleculen een rol, zoveel is wel duidelijk. En wie zegt dat het ook zo in planten werkt? 'Het huidige model is op zijn best een karikatuur van de werkelijkheid', aldus Dunlap. Maar hij erkent dat het de laatste jaren snel gaat. Meijer is het daarmee eens. “Elektrofysiologie en genetica beginnen langzaam naar elkaar toe te kruipen”, zegt ze en ze legt haar meest recente resultaten voor die gepubliceerd zullen worden in The Journal of Neuroscience. “Bij levende ratten heb ik elektroden in de SCN gebracht, vlakbij een klokcel. De elektrode meet het elektrisch veld rondom zo'n cel en daarmee kun je de activiteit van de cel meten. Het was een hels karwei. De ratten lopen vrij rond, zo'n elektrode verschuift dan nogal snel. In vier jaar is het me toch gelukt om gegevens van 10 klokcellen te verzamelen. Het zijn mooie metingen, bijvoorbeeld naar de invloed van licht.”

De rat ziet zo'n lichtflits. De optische zenuw vangt het lichtsignaal op. De zenuwcellen die naar de SCN lopen geven dat signaal door, ze geven de neurotransmitter glutamaat af. De klokcellen in de SCN reageren daarop. Hun interne calciumconcentratie stijgt en dat heeft weer een hele cascade aan gebeurtenissen tot gevolg. Uiteindelijk resulteert het in het afschrijven van de klok-genen. Meijer: “Hoe die cascade loopt is nog niet helemaal duidelijk. Maar de betrokken moleculen zullen we de komende jaren te pakken krijgen.”

    • Marcel aan de Brugh