Opsporing verzocht; DNA-chip brengt detectie van ziekteprocessen in stroomversnelling

Het Amerikaanse bedrijf Affymetrix produceert DNA-chips. Ze detecteren varianten van het aidsvirus, of kankergenen. 'High-brow technologie, echt fantastisch.'

'BUITENGEWOON spectaculair', zegt biochemicus prof.dr. H. Tabak van het Academisch Medisch Centrum in Amsterdam, als hij over DNA-chips begint. En even later: “Een intellectueel hoogstandje qua denkwerk, high brow technologie. Echt fantastisch.”

Over DNA-chips wordt op dit moment alleen in superlatieven gesproken. Makkelijk te gebruiken, snel resultaat. “Een zee aan mogelijkheden”, schreef Nature Biotechnology vorige maand in een overzichtsverhaal over de DNA-chips. Dat zijn geen waarmee je kunt rekenen zoals met computer-chips. De naam slaat op de productietechniek: strengen DNA worden basepaar na basepaar op kleine glasplaatjes gesynthetiseerd met fotolithografische technieken die ook de chip-industrie gebruikt.

Het duurt nu vaak nog weken om bij een patiënt met een erfelijke ziekte de mutatie vast te stellen in het gen dat de ziekte veroorzaakt. Bij erfelijke vormen van borstkanker is dat bijvoorbeeld het geval. Via een DNA-chip voor borstkankergenen bepaalt een arts binnen twee dagen op welke mutatie het erfelijke risico is terug te voeren. Een arts neemt daarvoor een druppel bloed of wat wangschraapsel van de patiënt, isoleert en kopieert DNA en brengt dat in oplossing in contact met de chip. Een dag later leest een computer de uitslag af.

Met name ziekten waarbij meer genen een rol spelen, bijvoorbeeld hart- en vaatziekten of de ziekte van Alzheimer, zullen naar verwachting veel sneller op te sporen zijn. En Tabak is ervan overtuigd dat DNA-chips het fundamenteel genetisch onderzoek ingrijpend zullen veranderen. Nu kunnen genetici één, hooguit twee genen tegelijkertijd bestuderen. “Met de DNA-chips vang je veel meer genen in je blikveld. Je kunt bijvoorbeeld de activiteit van alle 6.200 genen van gist op de voet volgen. Welke worden afgelezen, welke niet? Welke werken samen, hoe staan ze met elkaar in verband? Wat gebeurt er als de cel onder stress komt te staan, of als de cel zich wil gaan delen? De chip verraadt het.” Aldus Tabak, die in Amsterdam de erfelijke grondslagen van de vetstofwisseling bij gist onderzoekt. Gist staat model voor de mens, bij wie inmiddels een tiental erfelijke vetstofwisselingsziektes bekend is.

GIST-OP-DIEET

Afgelopen december publiceerde het Amerikaanse biotechnologiebedrijf Affymetrix een studie in Nature Biotechnology. De onderzoekers vergeleken gistcellen die in verschillende omstandigheden leefden. In het ene geval stond gist op een streng dieet, in het andere geval groeide de eencellige in een rijk voedingsmedium. Met DNA-chips keken de Amerikanen of er verschillen waren in genetische activiteit. In de gist-op-dieet werden vooral stress-genen veel vaker afgelezen. In de weldoorvoede gist waren juist de genen die voor snelle groei zorgen, veel actiever. “Zulke vergelijkingen konden we tot nog toe niet maken. Het is de eerste keer dat de wetenschap een bredere blik gegund wordt in het functioneren van een cel. En dat is wennen”, zegt Tabak die zelf de vetstofwisseling van gist bestudeert. “We zijn bijna allemaal superspecialisten. Ik weet wel iets van de genen die bij de vetzuurafbraak betrokken zijn, maar van die andere 6000 weet ik niks. We zijn de afgelopen jaren steeds dieper in gaan zoomen op details. De ontwikkeling gaat nu weer full swing de andere kant op. We zoomen uit en kunnen het hele genoom afturen.”

Van DNA-chips bestaan verscheidene varianten. Meest besproken is die van Affymetrix, een biotechbedrijf in Santa Clara, Californië. Hoewel de techniek door een team van vier wetenschappers is ontwikkeld, wordt het briljante idee erachter toegeschreven aan Stephen Fodor, de wispelturige zoon van een arts uit Seattle.

Fodor gaf zijn medicijnenstudie abrupt op om te gaan werken op een aardappelboerderij waar hij zijn favoriete hobby kon beoefenen: vliegvissen. Maar hij raakte snel verveeld, begon een studie landbouwkunde aan de Washington State University en trok daar al snel de aandacht vanwege zijn behendigheid met de elektronenmicroscoop. Hij werd aangesteld als assistent onderzoeker. Fodor kwam voor het eerst in zijn leven in aanraking met high-tech-apparatuur. Dat beviel hem erg goed. Hij voltooide zijn studie aan Princeton, verhuisde naar de University of California in Berkeley en kwam onder de ogen van Alejandro Zaffaroni's scouts.

Zaffaroni is een zeer succesvolle ondernemer. Hij heeft een aantal chemische en biotechnologische bedrijven opgezet die inmiddels jaaromzetten van vele miljoenen guldens hebben. Fodor kreeg een baan bij Affymax, het bedrijf dat de combinatorial chemistry ontwikkelde. Met deze techniek kan een chemicus binnen een dag tienduizenden moleculen maken. Voorheen kostte elke nieuwe verbinding hem vele weken werk. Affymetrix is een afgesplitste dochteronderneming van Affymax. Fodor werd er directeur. Tabak: “Fodor mag dan wel de naam hebben een eigenwijs en onhandelbaar persoon te zijn, maar er zat wel iets goeds tussen zijn oren. Hij heeft technieken uit de biochemie en de chipindustrie gecombineerd tot iets heel moois.”

Fodor bedacht een methode om vanaf een chipoppervlak duizenden korte DNA-ketens, zogenaamde oligonucleotiden, op te bouwen. Hij gebruikt daarvoor de vier basen adenine (A), thymine (T), cytosine (C) en guanine (G), beschermd door met licht afsplitsbare chemische groepen. De lichtgevoelige groepen beschermen de basen tegelijkertijd tegen koppelingsreacties met base. Op plaatsen waar nu bijvoorbeeld de base A aan de nucleotideketen moet binden, wordt de chip belicht. Het lichtgevoelige materiaal verdwijnt daar van het uiteinde van de nucleotideketens zodat de volgende base met weer een lichtgevoelig uiteinde er aan kan worden gesynthetiseerd. Met opeenvolgende belichtingen en reacties worden de oligonucleotiden stapsgewijs opgebouwd tot een lengte die kan variëren van 10 tot 20 bouwstenen. Zo kunnen duizenden verschillende oligo's worden gecombineerd op een chip die een oppervlak heeft van 1,5 cm.

WANGSCHRAAPSEL

De diagnostiek vindt plaats door bijvoorbeeld bloed, wangschraapsel of tumorweefsel van iemand te nemen. Hieruit worden van het te onderzoeken gen via de polymerase ketting reactie miljoenen kopieën gemaakt. Daaraan worden fluorescerende labels gehecht. De kopieën worden in oplossing over de chip gespoeld en hybridiseren met de bijpassende oligo. Neem het gen voor cystische fibrose (taaislijmziekte). Bij het merendeel van de patiënten is één base gemuteerd in dit honderden basen lange cystische-fibrose-gen (CF-gen). Maar er komen ook andere mutaties voor. Een tiental mutaties veroorzaakt ongeveer 90 procent van alle ziektegevallen. De arts isoleert een aantal cellen van de patiënt, kopieert het CF-gen en brengt die in contact met de chip. Het gemuteerde gen hybridiseert met het ene oligo waarmee het volledig complementair is. Een A koppelt aan een T (en omgekeerd) en een C aan een G (vice versa). Dus de volgorde ATTCCGGCT hybridiseert met TAAGGCCGA. De plaats op de chip waar een gelabeld gen aan een oligo bindt, wordt met een fluorescentie-laser uitgelezen. Bekend is welke oligo op welke plaats zit.

Affymetrix heeft tot op heden drie DNA-chips op de markt gebracht. Eén voor de detectie van het aidsvirus HIV. Op deze HIV GeneChip zitten ruim 16.000 oligo's. Ze corresponderen met allerlei genetische varianten van het aidsvirus, onder andere degene die resistent zijn tegen medicijnen. Een arts kan in een mum van tijd controleren of een patiënt resistente virussen in zijn bloed heeft. Daarop kan hij eventueel de medicatie aanpassen. Een andere DNA-chip is die voor de detectie van het p53-gen. Dit gen is gemuteerd in meer dan het helft van alle tumoren. Met de chip, waarop meer dan 50.000 oligo's zitten, is na te gaan of iemand een gemuteerd p53-gen heeft. En zo ja, welke mutatie dat precies is. Ook in dit geval kan de uitslag van invloed zijn op de behandeling. De derde chip is die voor de detectie van het gen cytochroom p450. Hiermee kunnen artsen de effectiviteit van medicijnen controleren (zie kader).

Voor het onderzoek aan gist combineerde Affymetrix vier chips waarop in totaal 260.000 oligo's zaten. Uiteindelijk wil het bedrijf al die oligo's op een enkele chip krijgen. En op den duur moeten er chips komen met miljoenen oligo's waarmee alle, naar schatting tachtigduizend genen van de mens te bestuderen zijn.

Affymetrix ontwikkelt ook een chip voor de detectie van het BRCA1-gen, samen met onderzoekers van het National Center for Human Genome Research in Bethesda, Maryland. Een gemuteerd BRCA1-gen geeft een grotere kans op vroegtijdige ontwikkeling van borst- en ovariumkanker. Bij 2 tot 5 procent van alle borstkankers is dit gen gemuteerd. De plaats van de mutatie varieert. Er zijn inmiddels ruim honderd mutaties van dit gen bekend. Affymetrix maakte een chip met daarop bijna 100.000 verschillende oligo's, elk 20 nucleotiden lang. Ze vertegenwoordigden alle mogelijke mutaties van het BRCA1-gen. De Amerikanen onderzochten het gen bij 15 patiënten. Van 14 personen konden ze de mutatie feilloos vaststellen. Bij één patient was de diagnose vals negatief.

De methode is dus nog niet volledig betrouwbaar. Affymetrix probeert dit te verbeteren. “En hun technologie heeft nog een ander nadeel”, zegt dr. J. den Dunnen, verbonden aan de afdeling Anthropogenetica van de Rijksuniversiteit Leiden. De groep van Den Dunnen wil DNA-chips gaan gebruiken voor de analyse van erfelijke spieraandoeningen. “Zij is amper beschikbaar. Er is een lange wachtlijst van geïnteresseerden die allemaal een andere erfelijke ziekte willen bestuderen. Affymetrix gaat alleen met de commercieel interessantste in zee. Je kunt de test niet zelf ontwikkelen want alles is afgeschermd met patenten. Dus zoek je een alternatief. En dat is de micro-array.”

PUTJES

De micro-array is een ander type DNA-chip. Hij is ontwikkeld door Mark Schena en Patrick Brown, twee biochemici van Stanford University Medical Center. Hun techniek is openbaar beschikbaar. Schena en Brown maken de oligo's niet vanaf het chipoppervlak, de stukken DNA worden kant en klaar op het glas geplakt. Het begint met een plastic plaat (ongeveer 100 cm) die 96 putjes bevat. In ieder putje doen ze een stukje DNA, corresponderend voor een bepaald gen. Het DNA wordt vermenigvuldigd via de polymerase ketting reactie. Daarna zuigt een machine via een soort printerkop wat DNA op uit het eerste putje. Dat brengt hij aan op een microscoopglaasje (ongeveer 15 cm), op een van te voren bepaalde plek. Daarna zuigt de printerkop wat DNA op uit putje twee en brengt ook dat op het glaasje aan, vlak naast het DNA uit putje een. En zo verder. Willen ze meer dan 96 genen bestuderen, dan gebruiken de Amerikanen eenvoudig wat extra plastic platen. De eerste chips die Schena en Brown maakten bevatten ruim 1000 stukken DNA op een oppervlak van 1 cm.

Met hun chip hebben Schena en Brown onder andere de zandraket (Arabidopsis thaliana) onderzocht. Ze vergeleken de genexpressie in blad en wortel. De twee Amerikanen isoleerden alle afgelezen genproducten, de boodschapper RNA's (mRNA), uit blad en wortel. De mRNA's uit het blad kregen een rood fluorescerend label, die uit de wortel een groen label. Daarna deden ze de mRNA's gemengd op de chip. Daarop zaten stukjes DNA die correspondeerden met 44 genen van de zandraket. Ieder mRNA hybridiseert alleen met het gen waarvan hij het product is. Een rood stipje op de chip duidt op een gen dat alleen wordt afgelezen in het blad. Een groen signaal staat voor een gen dat in de wortel tot expressie komt. Aan de intensiteit van het lichtsignaal is af te leiden hoeveel mRNA er in blad of wortel zat, dus hoe actief het gen was. Is het gen in beide delen actief, dan ontstaat een mengkleur. Een computerprogramma bepaalt via de kleur de ratio van rood en groen en daarmee het verschil in expressie in blad en wortel. Schena en Brown vonden duidelijke verschillen. De expressie van het licht-afhankelijke CAB1-gen was in het blad 500 keer hoger dan in de wortel. De expressie van 26 andere genen verschilde met ten minste een factor vijf.

Op dezelfde manier vergeleken Schena en Brown de genexpressie in gewone cellen en melanoomcellen. Ook hier vonden ze duidelijke verschillen. Dergelijk onderzoek geeft een beter inzicht in de genetische activiteit van kankercellen.

Inmiddels is een aantal andere bedrijven en universiteiten op de commercieel interessante ontwikkeling van DNA-chips gesprongen. Ieder heeft zijn eigen methode. Het Amerikaanse bedrijf Incyte Pharmaceuticals maakt de oligo's op het chipoppervlak via een techniek die is afgekeken van de inkjet-printer. Het Duitse Kankerinstituut in Heidelberg maakt oligo's waarvan de bouwstenen op een andere manier aan elkaar gekoppeld zijn. Daarmee proberen ze te voorkomen dat zo'n stukje DNA met zichzelf hybridiseert. Het gebeurt wel eens dat de oligo opkrult en dat bijvoorbeeld de volgorde ATTC ineens tegenover de sequentie TAAG komt te liggen. Dan kan er ongewenste hybridisatie optreden.

SPECIALE BOUWSTENEN

Het bedrijf Sequenom in San Diego, Californië, hecht de oligo's via een lasergevoelig molecuul aan het chipoppervlak. Na hybridisatie wordt de chip beschenen met een laser, de oligo's laten los en worden een voor een door een massaspectrometer geleid. Die bepaalt aan welke oligo en stuk DNA gebonden zit.

Ed Southern van de University of Oxford gebruikt voor de synthese van oligo's speciale bouwstenen. De A's, T's, C's en G's krijgen elk een label dat verschilt in massa. Bij hybridisatie laten die labels los. Een spectrometer bepaalt de opeenvolgende massa's en leidt daar de sequentie van het gehybridiseerde DNA uit af.

Den Dunnen leidt uit al deze aanpassingen af dat de techniek nog verre van optimaal is. “Ik hoor wel eens zeggen dat als we over een jaar naar de huisarts gaan met een zere keel, hij even via een DNA-chip bepaalt welke bacterie of welk virus voor de pijn zorgt. Maar dat is ver bezijden de werkelijkheid. Het duurt nog wel vijf jaar voordat ze bruikbaar zijn voor fundamenteel onderzoek. En we zijn zeker tien jaar verder voor ze in de kliniek mogen worden gebruikt.”

DNA op chips: De HIV GeneChip van het Amerikaanse bedrijf Affymetrix. In het centrum van het apparaat ligt een chip van 1 cm. Deze bevat ruim 16.000 verschillende hokjes, elk met een oppervlak van 95 m bij 93 m. In elke cel worden met fotolithografische technieken miljoenen identieke stukjes DNA (oligo's) opgebouwd die elk uit 10 tot 20 basen bestaan. Iedere cel bevat een oligo met een andere DNA-volgorde en correspondert in het geval van de HIV Gene Chip met een variant van het aidsvirus. Uit het bloed van een patiënt wordt viraal RNA geïsoleerd. Aan kopieën ervan wordt een fluorescent label vastgezet waarna ze de kans krijgen te binden aan overeenkomstige nucleotidenvolgorden aan oligo's op de chip. Een plaats waar viraal RNA aan een oligo bindt wordt door een laser herkend aan een rode kleur. Hoe roder een cel, hoe zekerder de uitslag.

Affymetrix gebruikt technieken uit de chip-industrie bij het maken van DNA-chips. Het chipoppervlak is bedekt met een laag van een lichtgevoelig polymeer. Bij belichting door een masker verdwijnt op de belichte plekken het lichtgevoelige materiaal. Daar wordt vervolgens een base (een A, T, G of C) aan gesynthetiseerd. Iedere base is zelf voorzien een lichtgevoelig uiteinde. Door een nieuw masker te nemen wordt daarna een ander deel belicht en kan een andere base op een andere plaats worden gesynthetiseerd. Dat proces herhaalt zich totdat er oligo's zijn gebouwd met een lengte van 10 tot 20 basen.