Doe de dna-shuffle; Husselen van genen verbetert functie van eiwitten

Betere wasmiddelen, gemakkelijker goudwinning of een effectiever groeihormoon. Het Amerikaanse biotechbedrijf Maxygen heeft een techniek ontwikkeld om eiwitten beter toe te snijden op hun taak.

'WE BOOTSEN de evolutie na in de reageerbuis, maar wij laten hem sneller verlopen. Wat de natuur eeuwen of zelfs millennia kost, duurt bij ons slechts enkele dagen', zegt dr. Willem P.C. Stemmer aan het begin van de rondleiding. Het is zaterdag, rond het middaguur. Op het parkeerterrein van het biotechbedrijf Maxygen in Santa Clara, Californië, staan vandaag slechts drie auto's. Onder andere de sportwagen van Stemmer, wetenschappelijk directeur van het twee jaar geleden opgerichte Maxygen. Stemmer, van oorsprong Nederlander, is de geestelijk vader van een techniek die hij DNA-shuffling heeft genoemd. Eiwitten doorlopen in dit proces een versnelde evolutie en raken in korte tijd beter toegesneden op hun taak, bijvoorbeeld de afbraak van gifstoffen of de productie van speciale suikers. De techniek is bruikbaar voor de bereiding van vaccins, bij gentherapie of de verbetering van bijvoorbeeld insuline en groeihormoon. Een ander gebied is dat van de industriële enzymen die bijvoorbeeld worden gebruikt in wasmiddelen, voor papierbehandeling, voor de verwerking van wijn, voor de broodbereiding en de modificatie van oliën en vetten. “Helaas kunnen we niet alles aanpakken. We moeten ons beperken tot een of twee gebieden”, zegt Stemmer. Vorig jaar september sloot Maxygen een overeenkomst met het Deense bedrijf NovoNordisk, 's werelds grootste producent van insuline en industriële enzymen.

Stemmer gaat opvallend casual gekleed. Helderwitte, robuuste Nike-gympen, grote bermudabroek en een luchtig polo-shirt. “Er heerst hier een korte-broekencultuur. Vooral in de buurt van San Diego en de stranden ten noorden van La Jolla. Daar heb je veel cafés en restaurants, mensen ontmoeten elkaar buiten. Het gaat er allemaal relaxed toe. Dat bevalt me. Bovendien is deze streek een hotspot van biotechbedrijven waardoor je veel collega's ziet en spreekt. Voor een biotechnoloog kan ik geen mooiere plek bedenken om te wonen”, zegt Stemmer vlak voordat hij via de bewaakte deur naar binnen gaat. “Trouwens, let niet op de rotzooi die je zo meteen ziet. We zitten net in een flinke uitbreiding.”

ANTIBIOTICUM

Bij DNA-shuffling worden stukjes erfelijke informatie opnieuw gerangschikt. Het begint met een of enkele genen. Zo'n gen wordt eerst in stukken geknipt, met het enzym DNase. De fragmenten worden daarna vermenigvuldigd via de polymerase chain reaction (PCR). Maar dat proces verloopt niet vlekkeloos. Het enzym DNA-polymerase maakt tijdens het kopiëren hier en daar een fout. Na de PCR worden de fragmenten in een willekeurige volgorde weer aan elkaar geplakt. Er ontstaan allerlei mogelijke producten, met allerlei combinaties van mutaties. De variatie is enorm.

Wat dat kan opleveren, liet Stemmer vier jaar geleden zien. Hij testte zijn techniek op het TEM-1 gen van de bacterie Escherichia coli. Dit gen bevat de informatie voor een enzym (een beta-lactamase) waarmee de bacterie zich kan beschermen tegen het antibioticum cefotaxime. Stemmer haalde het gen uit de bacterie, knipte het in stukken en plakte die stukken at random aan elkaar. Binnen een dag had de biotechnoloog miljarden varianten van het TEM-1 gen in handen. Die zette hij weer terug in E. coli. Veel bacteriën konden niks met het nieuwe geshuffelde gen. Het werd niet afgelezen. Maar sommige bacteriën bezaten een verbeterde versie van het TEM-1 gen. Ze maakten een eiwit dat een veel betere bescherming bood tegen cefotaxim. Ze konden een 32.000 keer zo hoge concentratie van het antibioticum verdragen, vergeleken met de bacteriën waarmee Stemmer zijn experiment was begonnen. Het verbeterde TEM-1 gen bevatte negen puntmutaties. (Nature, 4 augustus 1994).

Het idee achter DNA-shuffling kreeg Stemmer zo'n zes jaar geleden. Hij was toen al twaalf jaar weg uit Nederland, waar hij biologie had gestudeerd aan de Universiteit van Amsterdam. Stemmer: “Het ondernemingsklimaat voor biotechnologie in Europa was destijds erg slecht. In Amerika lagen de mogelijkheden.” Hij promoveerde aan de Universiteit van Wisconsin, werkte daar vervolgens nog twee jaar, maar verhuisde in 1987 naar het bedrijf Hybritech in San Diego. Daar hield hij zich bezig met het verbeteren van antilichamen voor immuuntherapie. Vijf jaar later begon hij bij Affymax, het bedrijf dat de combinatorial chemistry ontwikkelde. Met deze techniek kan een chemicus binnen een dag tienduizenden moleculen maken. Voorheen kostte elke nieuwe verbinding hem vele weken werk. In 1995 werd Affymax voor 540 miljoen dollar opgekocht door het farmaceutische bedrijf GlaxoWellcome. Combinatorial chemistry is inmiddels een standaardtechniek voor alle grote farmaceutische, chemische en agro-industriële bedrijven.

Bij Affymax begon Stemmer een alternatief te ontwikkelen voor rational drug design, de klassieke manier om eiwitten te verbeteren. “Het idee achter rational design is goed, maar de methode is duur, tijdrovend en moeilijk. Je maakt kristallen van je eiwit, je bestudeert de driedimensionale structuur van het molecuul en probeert de regio's te vinden die belangrijk zijn voor de functie van het eiwit. Op die plaatsen ga je aminozuren vervangen om te kijken of dat effect heeft op de werking van het molecuul. Een groep in Stanford heeft bijvoorbeeld jarenlang gewerkt aan het TEM-1 eiwit. Via de klassieke modelling kregen ze uiteindelijk een enzym dat een 16-voudig hogere resistentie had tegen cefotaxim. DNA-shuffling levert in veel kortere tijd een beter resultaat.”

DNA-shuffling is pragmatisch. Je hebt een doel voor ogen, bijvoorbeeld een betere afbraak van vetvlekken of een langer werkend insuline. Je maakt duizenden varianten van een eiwit en zoekt naar een verbeterde versie. “Hoe de driedimensionale structuur van zo'n molecuul verandert interesseert me niet. Het werkt, dat is voor mij voldoende”, zegt Stemmer, terwijl hij de bezoeker een blik gunt in een net geverfde ruimte waar PCR-machines en eiwit-analyse-apparatuur nog in hun plastic verpakking staan.

Binnen Affymax stuitte Stemmers techniek op veel weerstand. En wetenschappelijke bladen stuurden zijn artikelen terug met de vermelding 'niet geaccepteerd'. Maar Stemmer bleef volharden. Hij geloofde in zijn methode, waarvan hij het principe uit de natuur had afgekeken. “Daar wordt ook geshuffeld, alleen heet het dan recombinatie. Het gebeurt bij iedere geslachtelijke celdeling waarbij het erfelijk materiaal over twee cellen wordt verdeeld. Voor dat gebeurt, wisselen chromosomen kleine stukjes DNA uit. Het is een van de manieren om de genetische variatie in stand te houden.”

GOUDWINNING

Stemmer heeft zijn methode inmiddels op meer eiwitten getest. Bijvoorbeeld op de eiwitten die bacteriën resistent maken tegen arseen. De genen voor deze eiwitten - arsR, arsB en arsC - liggen achter elkaar op een plasmide (een cirkelvormig stukje DNA). Stemmer voerde de DNA-shuffle uit op het plasmide en selecteerde de meest resistente bacteriën. Daarna voerde hij shuffle en selectie nog twee keer uit. Uiteindelijk kreeg hij bacteriën die veel ongevoeliger waren voor arseen dat de eerste eencelligen. Ze overleefden een 40 keer hogere concentratie van het gif (Nature Biotechnology, mei 1997). Het zou van toepassing kunnen zijn bij de winning van goud uit erts. Bacteriën worden al gebruikt bij dit proces. Helaas bevat het erts hoge concentraties arsenopyriet, een stof die giftig is voor veel bacteriën. Een hogere resistentie tegen arseen zou de bacteriële goudwinning kunnen vergemakkelijken.

Via DNA-shuffling kan een enzym een totaal nieuwe functie krijgen. Dat bleek uit experimenten met het gen voor -galactosidase. Dat gen codeert voor een gelijknamig enzym dat de suikergroep galactose van moleculen kan splitsen (het splitst lactose bijvoorbeeld in galactose en glucose). Het -galactosidase gen doorliep elf rondes van DNA-shuffling. De varianten werden steeds geselecteerd op hun activiteit om een andere suikergroep, -fucose, af te splitsen. Enzymen met deze eigenschap komen in de natuur weinig voor. Het geshuffelde eiwit splitste fucose-groepen 10 tot 20 keer beter af dan het eiwit waarmee de experimenten werden begonnen. Stemmer: “Je kunt willekeurig welke eigenschap laten evolueren, als je maar een goed selectiecriterium hebt.”

Ondanks dit soort succesjes wilde Affymax niet investeren in Stemmers techniek. Volgens de Nederlander zat er daarom maar één ding op: verzelfstandigen. Dat gebeurde twee jaar geleden. Maxygen bezit alle intellectuele rechten op de shuffling technologie, maar GlaxoWellcome behoudt het recht om de techniek binnen eigen deuren te gebruiken.

Intussen hebben Stemmer en zijn collega's de shuffle-techniek verder verbeterd. In Nature verschenen twee weken geleden de resultaten van een experiment met een -lactamase gen. De biotechnologen haalden het gen ditmaal niet uit E. coli, maar uit vier andere micro-organismen: Citrobacter freundii, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae en Yersinia enterocolitica. Vervolgens deden ze twee verschillende proeven. In de ene proef hielden ze het gen van elk micro-organisme apart. Elk gen werd vermenigvuldigd, geknipt en geplakt. De geshuffelde genen werden in bacteriën van de soort E. coli gezet. Sommige bacteriën bleken ineens bestand tegen een acht maal zo hoge concentratie van het antibioticum moxalactam. In de andere proef voegden de Amerikanen de -lactamase genen van de vier micro-organismen bij elkaar. Daarna voerden de biotechnologen dezelfde procedure uit. Stemmer noemt dit family shuffling, omdat er een familie van genen wordt gehusseld. Deze aanpak bleek veel succesvoller. Sommige bacteriën waren niet acht keer, maar 540 keer ongevoeliger voor moxalactam dan de bacteriën waarmee ze de proef begonnen. “Family shuffling is een duidelijke verbetering op de standaard DNA-shuffling techniek”, zegt Stemmer terwijl hij het einde van de rondleiding aankondigt. De portier glimlacht vriendelijk terwijl ze de deur opent. De lucht is nog steeds helderblauw. Stemmer bedankt de bezoeker vriendelijk voor zijn komst en loopt naar zijn sportwagen. “Ik heb een afspraak op het strand. We gaan barbecuen.”