ALTERNATIEVEN STUITEN OP ONWELWILLENDE WETGEVER; Het taaie leven van het proefdier

Het aantal gewervelde dieren dat aan proefnemingen wordt geofferd is in Nederland de laatste jaren gestaag gedaald. Maar gebruik van alternatieven wordt gehinderd door trage regelgeving.

TWEE KEER PER WEEK, om zes uur 's ochtends, rijdt een analist van het TNO Prins Maurits Laboratorium in Rijswijk naar een slachthuis in Roozendaal. Om zeven uur begint men daar varkens te slachten. Om negen uur is de analist terug in Rijswijk, 6 varkensoren en een liter varkensbloed rijker.

In het laboratorium monteert een onderzoeker de oren in de proefopstelling. Hij schuift een kunststof buisje in de slagader, en een in de ader. De bloedvaten worden eerst schoongespoeld met een zoutoplossing, vervolgens gaat er bloed doorheen. Daarna begint de proef. De onderzoeker brengt een chemische stof op het oor aan. In het bloed is vervolgens te meten hoeveel van die stof door de huid dringt, en hoeveel schade hij aanricht.

Het varkensoor is een van de vele modellen om de percutane permeatie van chemicaliën te bepalen. Met ander woorden, om na te gaan of, en in welke mate een chemische verbinding door de huid kan dringen. Voor de risico-evaluatie van stoffen, bijvoorbeeld cosmetica, is dit een belangrijk gegeven. De huid-irritatie-test wordt tot op heden meestal uitgevoerd op ratten. Om het gebruik van proefdieren te beperken zijn er de afgelopen jaren verschillende alternatieven ontwikkeld, waaronder het varkensoor. Daarnaast is er de orgaankweek, waarbij menselijke huidcellen in bakjes worden gekweekt. Een ander alternatief is de diffusiecel: twee op elkaar geschoven, kunststof kubussen met daartussen een lapje huid, meestal afkomstig van een varken (het dier vertoont qua huidfysiologie veel overeenkomsten met de mens). De bovenste kubus bevat de chemische verbinding, die via de huid in het onderste kamertje kan doordringen. De onderzoeker kan die diffusie meten.

VOORZICHTIG

“De wetenschap is druk bezig met het ontwikkelen van alternatieven, maar de regelgevende autoriteiten hebben een bijna vanzelfsprekende voorzichtigheid bij het accepteren van zulke tests. Een bestaande proef laat zich moeilijk verdringen omdat die zich al bewezen heeft”, aldus prof.dr. Bert van Zutphen, hoogleraar Proefdierkunde aan de Universiteit Utrecht. Hij is organisator van het Second World Congres on Alternatives and Animal Use in the Life Sciences dat van 20 t/m 24 oktober in de Utrechtse Jaarbeurs wordt gehouden.

Met dat trage wetgevende apparaat heeft dr. Menk Prinsen, onderzoeker bij TNO-Voeding, divisie Toxicologie, in Zeist, ervaring. In de afgelopen dertien jaar werkte hij mee aan de ontwikkeling van een alternatief voor de omstreden Draize eye irritation test, de procedure waarbij een konijn een chemische stof in het oogzakje krijgt gedruppeld. Als maat voor de toxiciteit van de geteste stof gelden onder andere de roodkleuring van het oog en de vertroebeling van het hoornvlies. Onderzoekers van TNO zochten naar een alternatief waarbij laboratoriumdieren overbodig waren. Ze kwamen op het idee om ogen van slachtkippen te gebruiken. Net als hun collega's uit Rijswijk vonden ze een slachthuis bereid materiaal te leveren. Het kippenoogmodel is inmiddels, met financiële steun van de Nederlandse Vereniging tot Bescherming van Dieren en de Anti-vivisectie Stichting, uitgebreid getest en, volgens Prinsen, geschikt gebleken als vervanging voor de Draize test. “Maar helaas maken de nationale en internationale overheden geen haast om de test verplicht te stellen”, aldus Prinsen.

“Ik kan de frustratie van de onderzoeker begrijpen, maar het is ook een beetje naïef”, zegt oud-TNO-medewerker dr. Herman Koeter, 'principal administrator' bij de Environmental Health and Safety Division van de OESO, de Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling, in Parijs, waarin de 26 meest geïndustrialiseerde landen verenigd zijn. “Je wil natuurlijk graag dat je test zo spoedig mogelijk wordt opgenomen in de regelgeving. Maar zodra je aanstuurt op internationale acceptatie krijg je met meer dan alleen wetenschap te maken. De test doorloopt een aantal rondes waarbij de lidstaten hun pijlen op het voorstel kunnen afschieten. Dat gebeurt dan ook vaak, niet in de laatste plaats doordat ze zelf een andere alternatieve test naar voren schuiven. Vaak moet de gekritiseerde test worden aangepast. Tijdens dat hele beoordelingstraject wordt er druk gelobbyd. Zodra een alternatief is opgenomen in onze richtlijnen, moeten de lidstaten hem accepteren.”

Tot op heden zijn er pas twee alternatieven opgenomen in de OESO-richtlijnen. Allebei zijn ze een vervanging van de LD50-test. Deze beruchte test geeft aan bij welke concentratie vijftig procent van de dieren sterft. In een klassieke LD50-proef test de onderzoeker drie concentraties van een middel op drie groepen van elk tien dieren. De alternatieven, de fixed dose procedure en de acute toxic classification, gaan uit van één concentratie die getest wordt bij slechts vijf dieren. Als deze proef vragen openlaat, wordt er een nieuwe ingezet bij een hogere of lagere concentratie. Koeter: “Het is weliswaar geen totale vervanging, maar toch een aanzienlijke vermindering van het aantal gebruikte dieren. Bovendien is het alternatief diervriendelijker, want de onderzoeker wacht niet tot de dieren sterven, zoals bij de LD50. Als een dier symptomen van toxiciteit vertoont wordt het gedood.”

Gevolg van de trage regelgeving is een stagnatie in de daling van het proefdiergebruik. In 1978, het jaar dat de Veterinaire Hoofdinspectie van de Volksgezondheid begon met de landelijke registratie van het aantal dierproeven, gebruikten de wetenschappelijke instellingen, instituten en industrieën in Nederland 1.572.534 gewervelde dieren. In 1991 was dat aantal gedaald tot 876.058, in 1992 werden er 794.400 dieren opgeofferd. In de daaropvolgende jaren ging het met kleinere stappen: in 1993 werden er 780.703 gewervelde dieren gebruikt, in 1994 waren dat er 770.888. Proefdierkundige Van Zutphen: “De grootste winst is de afgelopen tien jaar binnengehaald. Het is wishful thinking om de komende jaren vergelijkbare sprongen te verwachten. In Engeland zie je dat het aantal gebruikte proefdieren zich stabiliseert.”

Getallen voor Europa zijn er niet. De meeste Europese landen registreren hun proefdiergebruik pas sinds enkele jaren, in sommige landen bestaat zo'n registratie niet eens. Wereldwijd werden er vorig jaar naar schatting 100 miljoen gewervelde dieren gebruikt.

JAVA-APEN

De daling van de afgelopen jaren is volgens Van Zutphen toe te schrijven aan een combinatie van factoren: het achterwege laten van onnodige proeven, niet méér proefdieren gebruiken dan absoluut noodzakelijk is, proefdieren vervangen door alternatieven. Het RIVM gebruikt bijvoorbeeld niercellen van Java-apen voor de kweek van virussen. Daaruit bereidt het instituut virale vaccins, zoals het poliovaccin. Door een verbetering van de celkweek en een verhoging van de virusopbrengst heeft het RIVM het jaarlijks aantal benodigde apen weten terug te brengen van 3.000 tot zo'n 25. Organon heeft een nieuwe, 'proefdierloze' test ontwikkeld om de zuiverheid van preparaten van het de zwangerschapshormoon FSH te meten. Jaarlijks bespaart die meer dan tienduizend ratten. En farmaceutische bedrijven voeren de eerste screening op de tienduizenden geproduceerde chemische verbindingen niet langer uit in muizen en ratten. Ze maken gebruik van immunologische tests, van in vitro tests (celkweken), van computergegevens. Studenten biologie en geneeskunde krijgen anatomie-les op de computer; aanstaande chirurgen oefenen hun vaardigheden op kunstratten en -konijnen.

Nederland kent inmiddels een Nationaal Centrum Alternatieven voor Dierproeven, waar informatie is in te winnen over het onderwerp. Daarnaast is er sinds 1985 het Platform Alternatieven voor Dierproeven waarin overheid, industrie en dierenbeschermingsorganisaties zitting hebben. Het Platform stimuleert en coördineert de ontwikkeling van alternatieven met een jaarlijkse subsidie van 2,5 miljoen gulden.

Ondanks alle inspanningen laat de invoering van alternatieven op zich wachten. Zeker wat betreft de alternatieven die ontwikkeld worden voor het testen van stoffen waarvoor registratie nodig is: geneesmiddelen, bestrijdingsmiddelen, voedseladditieven, reinigingsmiddelen, cosmetische produkten. Koeter: “De meeste mensen die te maken hebben met de toelating van stoffen, hebben geen behoefte aan alternatieven. Ze zijn vertrouwd met de bestaande eindpunten. Ze weten bijvoorbeeld wat ze kunnen verwachten als een stof effecten heeft op de vruchtbaarheid van een dier. Nu zouden ze daarvoor in de plaats ineens een laagje cellen of een plakje huid krijgen met allerlei vreemde en onbekende gegevens. Verzoeken om acceptatie van alternatieven worden daarom vaak terzijde gelegd.”

De OESO-divisie van Koeter wordt vooral gesteund door de departmenten milieu en landbouw van de aangesloten dertig landen. Voor alternatieven op het gebied van de volksgezondheid is er een extra barrière. Koeter verwacht op korte termijn geen alternatieven in de OESO-richtlijnen op het gebied van bijvoorbeeld vaccinontwikkeling. Terwijl daar juist grote winst te behalen valt. Het ontwikkelen en in het bijzonder het testen van vaccins op werkzaamheid en veiligheid, eisen jaarlijks tienduizenden dieren. De Europese Pharmacopoeia, die de bereidingswijze en kwaliteitseisen van geneesmiddelen in Europa voorschrijft, heeft inmiddels alternatieven in haar richtlijnen opgenomen, waaronder een aantal van het RIVM. Bij het testen van het difterievaccin worden per vaccin 'nog maar' 64 dieren gebruikt. Dat waren er eerst 120. Deze ingreep geeft een jaarlijkse reductie van zo'n 10.000 dieren.

Een ander probleem bij het ontwikkelen van alternatieven is de validatie, het vaststellen van de betrouwbaarheid en de relevantie van een test. De proefopzet laat in dit opzicht nogal eens te wensen over. Zo werden negen van de meest veelbelovende alternatieven voor de Draize eye irritation test opgenomen in een grote internationale validatiestudie. Naast de kippenoogtest van Prinsen waren dat onder andere een konijnen- en een koeienoogmodel. Elk van de negen alternatieven werd door vier laboratoria gevalideerd via 60 chemische stoffen, variërend van niet-irriterend tot ernstig irriterend. De Draize test werd niet meegenomen in deze grootschalige studie. De beoordelende commissie achtte het ethisch onaanvaardbaar om daarvoor duizenden konijnen op te offeren. De onderzoekers moesten hun resultaten maar vergelijken met beschikbare data. De studie, die twee jaar geleden werd afgerond, eindigde in een teleurstelling. Geen enkel alternatief kwam er als valide uit tevoorschijn. Volgens Prinsen vanwege de onbetrouwbaarheid van de konijnendata. OESO-medewerker Koeter is van mening dat de opzet van de studie verkeerd was. Het ECVAM (European Centre for the Validation of Alternative Methods) heeft vorig jaar richtlijnen voor validatie opgesteld. De OESO heeft in januari, tijdens een workshop in het Zweedse Solna, consensus weten te bereiken op dit gebied. Koeter: “Jarenlang bestond er een controverse tussen Europa en Amerika. Nu hebben ze overeenstemming bereikt over de criteria die je moet toepassen om een test te valideren. We stellen daar op het moment een uitgebreide handleiding over samen die internationaal acceptabel is.”

Het ECVAM legt veel nadruk op de stapsgewijze benadering. Hoe meet je via een alternatieve methode bijvoorbeeld leverschade? Een in vitro test die gebruik maakt van gekweekte levercellen beantwoordt slechts een deel van de vraag. Er zijn verschillende typen levercellen; gedurende een kweek verandert bovendien de genetische activiteit van levercellen. In hoeverre zie je de normale omzettingen in de lever terug in een laagje cellen? De stapsgewijze benadering gaat uit van het idee dat er meer tests nodig zijn om een vraag op te lossen.

Ook de kippenoogtest van Prinsen is hier een voorbeeld van. De test mag al gebruikt worden voor de classificatie van ernstig irriterende stoffen. Als de proef echter uitwijst dat een chemische verbinding niet of matig irriterend is, volgt alsnog een dierproef. Het idee van de stepwise approach is volgens Koeter binnenkort terug te vinden in de OESO-richtlijnen. Koeter: “We zijn met een nieuwe puzzel bezig. Maar zolang we die puzzel niet compleet hebben, mogen we de oude niet weggooien. Tot ver in de volgende eeuw zullen we dierproeven nodig hebben om te bevestigen dat de veronderstellingen juist zijn.”

'De onzinproeven zijn er uitgezeefd'

'Het belangrijkste vind ik de attitudeverandering ten aanzien van het proefdiergebruik. Er wordt nu beter over nagedacht', zegt prof.dr. Bert van Zutphen, hoogleraar Proefdierkunde aan de Universiteit Utrecht. Na zijn studie biologie kwam hij, eind jaren zestig, bij de faculteit Diergeneeskunde in Utrecht terecht. 'Een van de eerste boeken die ik daar in handen gedrukt kreeg was dat van William Russell en Rex Burch, The Principles of Humane Experimental Techniques. Het heeft een onuitwisbare indruk op me gemaakt.'

In dat boek (1959) werd voor het eerst het concept van de drie R's geopperd. In Nederland werden dat de drie V's, van verfijning, vermindering en vervanging. Het zou het Leitmotif van de proefdierkunde worden. Van Zutphen: 'Hoewel ik nog steeds onderzoek doe, heb ik gemerkt dat ik het nadenken over datgene wat je doet, belangrijker vind dan het behalen van resultaten. Waarvoor gebruik je dieren, waar liggen de grenzen van het toelaatbare?'

Wetenschappers die dierproeven willen uitvoeren zijn tegenwoordig verplicht eerst een cursus proefdierkunde te volgen. En in elke instelling waar dierproeven plaatsvinden worden alle geplande proeven beoordeeld door een dierexperimentencommissie (DEC). De herziene Wet op de Dierproeven, vorige maand door de Eerste Kamer aanvaard, schrijft voor dat zo'n DEC uit minimaal zeven personen moet bestaan. Ten minste drie leden, onder wie de voorzitter, zijn niet verbonden aan de instelling waar de proef zich voltrekt.

Op deze manier zijn onzinproeven, zoals het testen van het effect van keukenzout op het sociaal gedrag van dieren, er uitgezeefd. Maar volgens de dierenbeschermingsorganisatie Proefdiervrij worden er 'nog steeds dierproeven uitgevoerd waarvan wij zeggen, wat heb je daar in godsnaam aan', aldus een woordvoerder van de vereniging. 'Bijvoorbeeld onderzoek naar erfelijke heupafwijkingen bij paarden. Dan laten ze 40 veulens geboren worden met zo'n afwijking. Pasgeboren ratten krijgen vrouwelijke hormonen ingespoten, om meer te weten te komen over de voorkeuren van man of vrouw. Wij zien daar het nut niet van in.'