Duizenden sleutels op zoek naar een slot

Over een paar jaar zijn dankzij het Human Genome Project alle 100.000 genen van de mens bekend. De eiwitprodukten ervan zijn aangrijpingspunten voor evenzovele medicijnen. Maar het tempo waarin die worden gevonden ligt veel te laag. Combinatorial chemistry moet de oplossing bieden.

Combinatorial chemistry is meer dan de naam zegt, meer dan alleen scheikunde. In dit snel ontwikkelende vakgebied is informatica en apparatenbouw even belangrijk als organische chemie. De bedoeling van combinatorial chemistry is om snel duizenden nieuwe chemische verbindingen te maken. Dit gebeurt door geautomatiseerd een selectie van enkele tot veertig kleine moleculen in alle mogelijke combinaties met elkaar te verbinden. De duizenden resulterende moleculen worden vervolgens snel getest op hun bruikbaarheid als medicijn. Ook de eerste test op medicinale eigenschappen gebeurt automatisch. Zo kunnen wekelijks duizenden nieuwe verbindingen worden getest. De grootste farmaceutische industrieën hebben inmiddels meer dan een miljard dollar in de nieuwe technieken geïnvesteerd.

Het idee voor combinatorial chemistry ontstond in 1981, onder de douche, in het hoofd van dr. Mario Geysen. Het ging Geysen toen nog niet om nieuwe geneesmiddelen. Hij had een immunologisch probleem en wilde vaststellen op welke plaats een antilichaam aan een virus bindt.

Die binding is de eerste stap in het opwekken van een afweerreactie, en de eerste stap naar de vernietiging van het virus. Bekend was dat een antilichaam aan een korte reeks van ongeveer vier aminozuren in een eiwitketen aan het virusoppervlak bindt. Niemand was er tot dan toe in geslaagd die vier aminozuren te vinden. Geysen opperde daarom om dan maar alle oligopeptiden van zes aminozuren lengte te maken. Op iedere positie in zo'n hexapeptide kunnen 20 verschillende aminozuren voorkomen. Dus Geysen wilde 20, ofwel 64 miljoen hexapeptiden synthetiseren. Het was 1981 en een goede chemicus deed over het maken van één zo'n oligopeptide een week.

Geysen is nu directeur combinatorial chemistry van het researchlab van het farmaceutische bedrijf GlaxoWellcome in Raleigh, in de Amerikaanse staat North Carolina. “Het isoleren van een epitoop - de aminozuurvolgorde waar het antilichaam aan bindt - was toen onbegonnen werk”, aldus Geysen. “Daarom dacht ik: ik maak ze allemaal. Ik beschreef het als een visnet waarin alle mazen er anders uitzien. Je haalt het net door een oplossing van je antilichaam en je kijkt aan welke maas het blijft hangen. Zo visualiseerde ik het. Het heette dan ook het antibody net project.”

De douche waar Geysen onder stond, bevond zich in de veiligheidssluis tussen het lab voor ziekteverwekkende virussen en de buitenwereld van het Centraal Diergeneeskundig Instituut in Lelystad. Mario Geysen kwam in 1944 als Nederlander ter wereld en emigreerde als kind met zijn ouders naar Australië. In 1981, nog in dienst van de Australische vaccinfabrikant Commonwealth Serum Laboratories, werkte hij in Lelystad tijdens een sabbatical year. Zijncollega-onderzoekers in de polder, en de prettige sfeer, had de Australiër leren kennen toen hij in het kader van een hulpproject van de Australische regering in Lelystad technieken leerde om in Indonesië de fabricage van een vaccin tegen mond- en klauwzeer op te zetten. Lelystad huisvest wereldexperts op het gebied van mond- en klauwzeervirussen. De eerste publikatie op het gebied dat zich later tot combinatorial chemistry ontwikkelde, staat op naam van Geysen en de Nederlanders prof.dr. Rob Meloen en dr. Simon Barteling van het CDI.

Geysen, van huis uit geen chemicus maar ingenieur, had al enkele ingenieuze vondsten op zijn naam staan. Geysen: “De chemie was er. Je kon alles kopen. We gebruikten de traditionele, immunologische ELISA-reacties om de uitkomst te meten en gebruikten gereedschappen gebaseerd op de 96 wells plates.” Ieder virologisch lab gebruikt kunststof platen met 96 ondiepe gaatjes voor reacties met kleine hoeveelheden reagentia. Iedere plaat telt 8 keer 12 reactiekommetjes en is ongeveer een decimeter lang. Geysen adopteerde dat formaat, nam een polyethyleen blok en boorde daarin 96 gaten van een enkele millimeters diameter. Dat zijn de reageerbuizen. Daarna maakte hij een deksel met 96 pinnen die in de 96 reageerbuizen passen. Het eerste aminozuur van ieder oligopeptide reageerde Geysen vast aan de pinnen. Door het deksel met de 96 pinnen achtereenvolgens in verschillende blokken met reageerbuizen te dopen, ieder gevuld met verschillende reagentia, komen de achtereenvolgende reactiestappen tot stand. Dit systeem was te automatiseren. Er bestond al apparatuur voor het vullen, legen en uitspoelen van de reageerbuisjes met automatische pipetten aan robotarmen. Ook de deksels met de pinnen laten zich automatisch verplaatsen, evenals de ELISA-reactie waarmee uiteindelijk wordt bepaald of een antilichaam bindt. De computer houdt bij welk peptide aan welke pin in welk blok wordt gesynthetiseerd.

Waarde

Geysen: “Het ging allemaal heel snel. In september '82 hadden we de eerste serie peptiden gemaakt. Ik kon toen in mijn eentje tien blokken van 96 pinnen per dag doen. Dus kon ik ongeveer 1000 peptiden per dag maken. Met het eerste experiment bewezen we de waarde van het systeem. De redactie van Nature nam de tijd om het manuscript te weigeren en de eerste publikatie verscheen daardoor pas in 1984, in de Proceedings of the National Academy of Sciences.”

Terug in Australië ontwikkelde en automatiseerde Geysen het systeem verder. Hij richtte met geld van zijn werkgever het bedrijfje Mimotopes op. Al spoedig bevatten de immunologische publikaties een verwijzing naar de mogelijkheid om met dit systeem ook peptiden te vinden die aan enzymen en receptoren binden. Het duurde niet lang of Geysen en zijn collega's in het zich ontwikkelende vakgebied onderkenden de potentie van combinatorial chemistry voor de geneesmiddelenontwikkeling.

Zonder uitzondering oefenen geneesmiddelen hun werking uit door zich te binden aan enzymen of receptoren. Receptoren zijn eiwitten die in de celwand van levende cellen liggen. Op het deel dat naar buiten steekt kan een passend boodschappermolecuul binden, waarna de receptor in de cel de boodschap doorgeeft dat een bepaalde chemische reactie moet worden uitgevoerd. Dat kan met de vertering van voedingsstoffen te maken hebben, met hormonale reacties, maar ook met denkprocessen en het ontstaan van emoties. De reacties worden gekatalyseerd door enzymen. Er zijn duizenden receptoren en tienduizenden enzymen actief in een mensenlichaam. Meestal bindt één verbinding specifiek aan één receptor, als een sleutel in een slot. Sommige geneesmiddelen blokkeren een receptor, zodat de natuurlijke signaalstof er niet meer aan kan binden. Andere geneesmiddelen binden aan enzymen en blokkeren hun werking.

Een jaar of twintig geleden hadden röntgenkristallografen zoveel molecuulstructuren van eiwitten ontrafeld dat het vakgebied rational drug design ontstond. Met het molecuulmodel van een enzym of receptor op het computerscherm zoeken chemici een bindingsplaats voor een klein molecuul. Vervolgens ontwerpen ze op het computerscherm een molecuul dat precies past. Een organisch chemicus synthetiseert daarna het molecuul, dat na testen als medicijn de markt op gaat.

Geysen: “Het idee achter rational drug design is goed, maar de methode heeft weinig opgeleverd, is moeilijk, duur en tijdrovend. Ik vind het handiger het probleem om te keren. Ik maak heel veel verschillende sleutels en laat het slot zelf een sleutel zoeken die een beetje past. Daarna maak ik heel veel variaties van de gevonden sleutel en laat het slot weer zoeken. Als je dat snel en effectief doet is het veel goedkoper dan de sleutelmaker voor ieder slot een speciale sleutel laten maken.” Combinatorial chemistry als opvolger van rational drug design.

De stormachtige ontwikkeling in de combinatorial chemistry zorgde al snel voor het gebruik van meer bouwstenen dan uitsluitend de 20 natuurlijk voorkomende aminozuren. Aanvankelijk werd het repertoire uitgebreid met synthetische aminozuren. In de loop van de jaren negentig zijn naast de peptidebinding ook een vijftigtal organisch-chemische reacties beschikbaar gekomen voor automatische verwerking in robotsystemen voor combinatorial chemistry. Behalve reacties die ruwe omstandigheden vereisen (in zeer zure of basische omgeving of onder hoge temperatuur), is nu vrijwel alles mogelijk.

Collectief intellect

In 1991 werd Geysens bedrijf Mimotopes door het Amerikaanse biotechbedrijf Chiron gekocht. Geysen ging mee, maar toen Chiron meer belangstelling had voor nieuwe geneesmiddelen dan voor uitbreiding van de combinatorial techniek, stapte hij in 1993 over naar Glaxo waar hij zijn ideeën wel kwijt kan. Het resulteerde begin dit jaar in de oprichting van een Diversity Sciences Centre, waarin Glaxo met een aantal universiteiten samenwerkt. Geysen: “De bedoeling is het paradigma van de combinatorial chemistry ruimer toe te passen. Van de hoge-temperatuur-supergeleiders is de theoretische verklaring bijvoorbeeld nog niet rond. Je kunt ze dus niet rationeel ontwerpen. In het combinatorial paradigma ga je uit van de beschikbare elementen waarmee je ze kunt maken. Die vind je in het Periodiek Systeem der elementen. Je kunt daarmee een begrensde matrix, of ruimte van alle mogelijke combinaties van elementen opzetten. Vervolgens moet je een procedure zoeken om ze te maken. Je hebt dan een library van mogelijke supergeleiders. Dat is waar Peter Schultz van Stanford University vorig jaar mee begonnen is en waar hij nu een bedrijfje voor heeft opgericht.”

Voor GlaxoWellcome was het in huis hebben van de grondlegger van de combinatorial chemistry niet voldoende. Vorig jaar, te midden van een stroom van overnames en aankondigingen van samenwerking tussen kleine combinatorial chemistry bedrijfjes en de grote farmaceutische mastodonten, kocht Glaxo voor een half miljard dollar Affymax, gespecialiseerd in combinatorial chemistry. Geysen: “Ik was dead against de aankoop van Affymax. Vooral omdat ze nauwelijks met organische chemie bezig waren.”

Bij Affymax in het Californisch Palo Alto is chief executive officer dr. Gordon Ringold niet onder de indruk van de mening van zijn collega aan de oostkust. Akkoord, Affymax heeft lang alleen aan peptiden en nucleotiden gewerkt. En peptiden hebben als nadeel dat ze als geneesmiddel niet in een pilletje kunnen worden verwerkt. Ringold: “Maar Glaxo heeft ons ook gekocht vanwege de mensen die er zitten en hun collectieve intellect. Onze inspanning is tegenwoordig wel degelijk gericht op organische synthese op een vaste drager. Dat veld was volkomen genegeerd, want de industriële en academische synthesechemici geloofden niet in synthese op een vaste drager. Er was een houding van: het werkt niet, de opbrengst is laag, de stereochemie is slecht. Maar in 1991 maakte een postdoc aan Berkeley uit losse bouwstenen volgens het principe van combinatorial chemistry de eerste benzodiazepine op een vaste drager. Dat gaf een omslag. Toen bleek dat het kon. Soms hebben we nog last van de cultuurkloof: wij willen een molecuul dat werkt, maar traditionele organisch chemici streven vaak naar schoonheid in het ontwerp van een molecuul.”

Affymax werd in 1989 opgericht door Alex Zaffaroni, een farmacoloog die zijn sporen heeft verdiend met het oprichten en grootmaken van enkele kleine bedrijfjes. Ringold: “De naam Affymax is een samentrekking van affinity matrix. Op de ene as van die matrix staan alle chemicaliën, honderdduizenden verbindingen, en op de andere as staan alle duizenden doelen, tienduizenden receptoren en enzymen. En wij gaan een manier ontwikkelen om alle combinaties te onderzoeken. Dat is veel werk, maar het is een simpel idee dat iedereen onmiddellijk begrijpt.”

Affymax-onderzoekers ontwikkelden de apparatuur en technologie om peptiden, nucleotiden (DNA) op siliciumchips en organische moleculen op kleine kunststof bolletjes te synthetiseren (kader). Net zoals Geysen zijn pin-systeem uitgebreid patenteerde, heeft Affymax de technologie en apparatuur om geautomatiseerd met bolletjes te werken verregaand gepatenteerd.

Ringold: “Zaffaroni realiseerde zich ook dat de kosten van de ontwikkeling van een geneesmiddel, nu ergens tussen de 300 en 500 miljoen dollar, uit te geven in tien jaar tijd, voor het grootste deel zit in het maken en testen van 5.000 tot 10.000 moleculen waar dat ene succesmolecuul uit wordt geselecteerd. Ieder molecuul, gemaakt door een goede chemicus, kost ongeveer 5.000 dollar. De farmaceutische industrie werkt traditioneel. Sinds 1880, toen Bayer salicylzuur veranderde tot aspirine, werkt één chemicus aan één molecuul. Dat is nooit veranderd. Als je erover nadenkt realiseer je je dat je veel geld stopt in research die meestal faalt. Natuurlijk, falen is het wezen van onderzoek. Als er niet veel zou falen zou het geen onderzoek zijn, dan is het zoiets als schoenen maken. Maar als je voor veel geld faalt, kost het veel geld om een keer te slagen. Affymax is gebouwd op een simpel concept: faal snel en faal goedkoop. Daarom hebben we de synthese- en de screeningstechnologie ook geïntegreerd. We breiden het principe zelfs uit tot de toxiciteitsproeven op micro-organismen en proefdieren. Je hebt niets aan een machine hebt die een miljoen moleculen per maand uitspuugt, als je er maar één per maand biologisch kunt testen.”

100.000 genen

Overal ter wereld vragen moleculair biologen en genetici zich momenteel af hoe de biochemie, de genetica en ook de farmacie en de geneeskunde er uit zullen zien als dankzij het Human Genome Project over een paar jaar alle 100.000 genen van de mens bekend zijn.

Voor Ringold betekent het vooral een verdere versnelling van het screeningswerk: “Nieuwe genen voor receptoren en enzymen, onze doelmoleculen, worden op het ogenblik dagelijks gevonden en gekloneerd. Het genoom project voorziet ons van meer informatie dan we kunnen bevatten. Tot nu toe waren er in de geneesmiddelenontwikkeling maar heel weinig moleculaire doelen met een duidelijke therapeutische toepassing beschikbaar. Met als gevolg dat die enkele receptor de sleutel tot iedere ziekte onder de zon was en werd onderworpen aan uitgebreid biomedisch onderzoek. Dat was een van de fundamentele fouten van de biotechnologische industrie. Die werkten met 25 chemici jaren aan één receptor om er achter te komen dat het ding toch niet zoveel betekent.”

Die tijd is voorbij. Ringold geeft een voorbeeld. Begin januari publiceerden onderzoekers van Roche de vondst van de receptor van het eetlustregulerende eiwit leptine. Die vondst is belangrijk voor de ontwikkeling van een medicijn tegen vetzucht. Ringold: “De basevolgorde van het gen van die receptor zat al in een openbare databank. Wij doen er tegenwoordig anderhalve week over om een gen in een databank om te zetten naar een voldoende hoeveelheid eiwit voor een screeningsprogramma. Het gen wordt in die tijd gemaakt, gekloond en tot expressie gebracht. Dat is geen werk meer voor gepromoveerde onderzoekers. Daar hebben we een klein fabriekje voor waar research-assistenten het werk doen. Afhankelijk van het type receptor - dat beoordeel je op grond van de basevolgorde of de functie - screen je het op een van de chemicaliënbibliotheken. Ik mag daar niet veel over zeggen, maar bij leptine gebruiken we een bibliotheek van peptiden, want leptine zelf heeft in het lichaam interactie met een groot eiwit.

“Hiermee wil ik illustreren dat het vooral aan komt op snelheid, vaardigheid en fabrieksmatig screenen. En mocht je niet snel iets vinden dat aan een doelmolecuul bindt, vergeet het dan voorlopig en richt je op een ander doel. Faal snel. Er zijn nog duizenden doelmoleculen met potentie over. Dus de procedure is: creëer een bibliotheek, test daarmee 500 doelmoleculen en als er 100 overblijven zijn dat er al meer dan alle biologische onderzoekers van alle grote farmaceutische industrieën momenteel aankunnen. Ik denk dat we nog een jaar, misschien twee, verwijderd zijn van het moment waarop we 500 doelmoleculen per jaar kunnen onderzoeken met daarvoor geschikte bibliotheken.”

    • Wim Köhler