Supervouwende serpentines

In de structuurchemie van eiwitten is de laatste twee jaar een revolutie gaande. Van 4250 eiwitten is de driedimensionale structuur bepaald. Er blijkt systeem in te zitten. Welke vouwingen hebben de eiwitten gemeen? En wat is hun evolutie?

'Ik ben erg in de war over de evolutie van deze eiwitten', zegt biochemicus dr. T. Sixma op het Nederlands Kanker Instituut in Amsterdam. 'Steeds denk je dat je weet hoe het zit, en dan is het toch weer anders.'

Ze haalt er een plaatje bij dat de drie-dimensionale structuur van een giftig bacterie-eiwit voorstelt. We zien een gekleurde kluwen, net een slordig stapeltje slingers en serpetines. In het opgevouwen eiwit zijn duidelijk twee stukken te onderscheiden, een A- en een B-subunit. De A-subunit is elipsvormig. De vouwing van de B-subunit, wijst Sixma, toont een mooie vijftallige symmetrie.

Verschillende toxische eiwitten hebben zulke A- en B-subunits, zegt ze. Maar bijvoorbeeld het toxine uit de bacterie die kinkhoest veroorzaakt, heeft vijf verschillende B-subunits en hij heeft de A-subunit op zijn kop. Het toxine uit de dysenterie-bacterie heeft wel de B-subunit, maar de A-subunit lijkt op die van het plantengif ricine. Difterie-toxine heeft dezelfde A-subunit als kinkhoesttoxine, maar weer een heel andere B-subunit. 'De eiwitten gebruiken deze subeenheden door elkaar', concludeert Sixma, 'en er is geen zinnig woord over te zeggen waarom het ene toxine in de evolutie de A-subunit heeft geconserveerd, en het andere juist de B-subunit.'

Dieren, planten en bacteriën hebben duizenden typen eiwitten. Een eiwit kan uit een of meer subunits bestaan, lange, gevouwen polypeptideketens van soms wel 10.000 aminozuren. De volgorde van de twintig verschillende aminozuren bepaalt de vouwing en de chemische eigenschappen van de subunits en dus de eiwitten. Sommige eiwitten dienen als bouwstenen voor de cel, ze vormen huidweefsel, bloedvatwanden of spieren. Andere functioneren als enzymen.

In 1958 slaagde W.L. Bragg er voor het eerst in om de drie-dimensionale structuur van een eiwit te bepalen. De onderzoekswereld was geschokt. Men had verwacht dat eiwitten net zo'n mooie, regelmatige structuur zouden hebben als DNA, waarvan de structuur een paar jaar eerder was vastgesteld. Maar het plaatje van het opgehelderde eiwit, myoglobine geheten, toonde een rommelige, gekronkelde worst. Bragg bepaalde de vouwing met dezelfde techniek als waarmee deze nu nog wordt vastgesteld, met röntgendiffractie. Van het opgeloste eiwit wordt een kristal gemaakt (door de microscoop zijn soms echt blinkende, gekleurde kristalletjes te zien), en vervolgens laat men er onder vele hoeken röntgenstraling doorheen gaan. Uit de diffractiepatronen is te berekenen hoe de atomen ruimtelijk ten opzichte van elkaar staan.

Tot 1990 kwamen er maar mondjesmaat eiwitstructuren bij - het was verschrikkelijk veel werk. Eiwitten waren niet zuiver, ze lieten zich moeilijk kristalliseren, de diffractiepatronen waren onnauwkeurig en berekeningen konden jaren in beslag nemen. Maar met het volwassen worden van de genetische technieken zijn eiwitten steeds makkelijker zuiver te krijgen. Daarnaast zijn allerlei andere technieken verbeterd, waaronder de rekencapaciteit van de computer. En eiwitstructuren kunnen nu ook gedeeltelijk met NMR (magnetische kernspinresonantie) en met elektronenmicroscopie bepaald worden.

Begin 1992 zaten er minder dan vijfhonderd eiwitstructuren in de data-banken, maar afgelopen oktober telden de banken er al 4.269. Structuuropheldering is voor veel biotechnologische bedrijven nu routine geworden. En het tijdschrift Nature is vorig jaar een aparte uitgave begonnen - Nature Structural Biology.

Wie tegenwoordig inzicht wil hebben in de levensprocessen, lijkt nauwelijks meer om de toenemende stroom van opgehelderde eiwitstructuren heen te kunnen. Immers, de basenvolgorden van de vele genen die inmiddels ook routinematig worden bepaald, zeggen weinig over de eiwitten waar ze voor coderen. En ze zeggen vaak nog minder over hoe de eiwitten hun werk doen. 'De problemen verleggen zich steeds', ervaart Sixma. 'Vroeger promoveerde je op de structuur van een eiwit. Nu kan dat nog wel, maar dan gaat het om een veel ingewikkelder of groter eiwit.'

Sixma werkt aan een eiwit dat samen met andere eiwitten DNA repareert. DNA moet bij elke celdeling vermenigvuldigd worden. Dat gaat de cel vrijwel altijd goed af, maar soms wordt een enkele base fout afgelezen. Deze fout wordt in zoogdieren herkend door de zogeheten MSH-eiwitten. Bacteriën hebben hiervoor het evolutionair verwante MUT-eiwit. Het is bekend dat een mutatie in een van de MSH-genen mensen gevoeliger maakt voor een bepaalde vorm van darmkanker. Waarschijnlijk omdat daarmee bepaalde fouten in het DNA zich ophopen waardoor celprocessen verstoord raken.

Van geen van deze hersteleiwitten is nog de kristalstructuur opgehelderd. De structuurbepaling ervan is extra spannend, omdat de basenvolgorde van het DNA dat voor deze eiwitten codeert, geen enkele aanwijzingen geeft uit welke domeinen (de werkzame onderdelen van de subunits) ze waarschijnlijk bestaan.

Dat is bij andere eiwitten vaak wel het geval. Voor de voorspelling van structuren uit DNA-sequenties, verschijnen regelmatig nieuwe computerprogramma's. En naarmate er meer structuren met bijbehorende DNA-sequentie worden gepubliceerd, komt het ook vaker voor dat biochemici bepaalde domeinen al in de basenvolgorde herkennen. In een gen vinden ze bijvoorbeeld de basesequentie voor het zogeheten SH3 domein. Dit bolvormige domein is al in flink wat signaaleiwitten gevonden, evenals in de enzymen die zijn betrokken bij knopvorming van gisten. Of de biochemici vinden de sequentie voor de langwerpige 'cystine knopen', een domein dat al is gevonden in ondermeer een groeifactor voor zenuwcellen, het zwangerschapshormoon en een neurotoxine.

Van het DNA-hersteleiwit is echter alleen bekend dat het een domein heeft dat is betrokken bij de omzetting van energie-drager ATP. Hoe het eiwit aan het DNA bindt, de fout herkent en de hersteleiwitten aan de gang helpt, is nog onbekend. Daarnaast is het een tamelijk groot eiwit: 'We proberen domeinen nu apart in handen te krijgen', legt Sixma de strategie uit. 'En behalve dat we daarvan dan de structuur bepalen, doen we ook biochemische testen om te kijken wat de domeinen doen.'

Sixma vermoedt dat er in de wereld nog een of twee andere onderzoeksgroepen de structuur van hetzelfde bacterie-eiwit trachten op te helderen. 'Dat is niet erg', vindt ze, 'het is een extra controle. Er is aan dit complex nog zoveel werk te verichten. Maar natuurlijk is het leuk om de eerste te zijn. Dat is echt spannend. Vooral als het om een structuur gaat die nog nooit eerder is gevonden.'

De honderden nieuwe eiwitstructuren die er jaarlijks bijkomen, verleiden de biochemici tot allerlei bespiegelingen over de evolutie en verwantschap van eiwitten. In oktober had het kwartaalblad Current Opinion in Structural Biology een overzicht van een aantal nieuwe families en superfamilies die afgelopen jaar zijn voorgesteld. Deze herfst bijvoorbeeld, is de metzinsin superfamilie in het leven geroepen. Deze omvat voorlopig alleen nog de families astacins (genoemd naar een eiwitknippend enzym van de rivierkreeft), adamalysins (grote bacteriële enzymen), serralysins (genoemd naar een slange-toxine) en matrixins (enzymen betrokken bij weefselvorming).

De vier families waren al eerder voorgesteld op basis van hun overeenkomsten in de aminozuurvolgorde. Maar nieuwe structuren leerden dat deze eiwitfamilies op hun beurt weer moeten worden ingedeeld in een superfamilie. Want hoewel ze qua DNA en aminozuurvolgorde nauwelijks overeenkomst hebben, komt hun elipsvormige vouwing erg overeen. Ze hebben in het eiwit ook allemaal een 'motief' met een zinkion erin, waarin hetzelfde aminozuur, methionine geheten, op dezelfde manier tegenover het zinkion is gepositioneerd. De motieven kenmerken zich ook door drie histidines rond het zinkion en een watermolecuul. Een bepaalde vouwing, alfa-helix geheten, houdt de groep op zijn plaats. Variatie zit eigenlijk alleen in de lussen aan de buitenkant. De buitenkant bepaalt waaraan het eiwit bindt.

De vraag is nu of de reactieve zinkplaats in de evolutie één keer is ontstaan en door primitieve eiwitten met uiteenlopende bindingseigenschappen is opgepikt. Of dat er uit één moedereiwit meerdere dochtereiwitten zijn ontstaan doordat de buitenkanten veranderden.

Het kan ook zijn dat het 'zinkmotief' meerdere malen in de evolutie is gevormd. Men vermoedt dat bij deze superfamilie steeds andere eiwitjes aan de reactieve zinkplaats zijn toegevoegd, waardoor het nieuw gevormde eiwit de ene keer de functie kreeg van een eiwitknippende toxine ter verdediging van het organisme, en de andere keer van een enzym dat het bindweefseleiwit collageen knipt, om zo dit bindweefsel te hermodelleren. 'Afgelopen jaren is gebleken', zo vat Current Opinion in Structural Biology samen, ' dat tijdens de evolutie voortdurend nieuwe eiwitten ontstonden door een samenvoeging van domeinen uit bestaande eiwitten.'

Over het aantal 'motieven' en 'domeinen' waaruit de eiwitten zijn opgebouwd, wordt druk gespeculeerd. Onderzoekers van de universiteit van Londen schatten vorig jaar in Nature (15 dec. '94) dat er niet meer dan 7.920 eiwitdomeinen kunnen zijn. De schatting baseerden ze op het aantal verschillende vouwingen die tot december 1993 waren gevonden. Onder de 3000 structuren kwamen ze 71 verschillende vouwingen tegen, die slechts bij één familie voorkwamen. Daarnaast vonden ze negen 'supervouwingen' - met mooie namen als 'Up-down', 'Double Wound', 'Jelly-roll' en 'Sandwich' - die voorkwamen bij drie tot elf eiwitfamilies. De families bleken geen overeenkomsten in de aminozuurvolgorde te hebben. De auteurs vermoeden dat deze 'supervouwingen' extra stabiel zijn, en daarom meerdere malen in de evolutie konden ontstaan.

Structuuropheldering van een nieuw, veel voorkomend domein, betekent een sterke stimulans voor het onderzoek. Plantenziektekundigen en biochemici van de Landbouwuniversiteit, onderzoeken nu een domein dat in december 1993 is opgehelderd. Het gaat om het Leucine Rich Repeats domein (LRR-domein). Deze heeft 20 tot 29 dezelfde, repeterende slingers in de vorm van een symmetrische, halve ronde. Inmiddels zijn al zestig eiwitten gevonden die dit leucine-rijke stuk bevatten (leucine is een van de twintig aminozuren).

Interessant voor de moleculaire plantenziektekunde is nu dat het domein is gevonden in meerdere plante- en bacterie-eiwitten die betrokken zijn bij de afweer van virussen, bacteriën of schimmels. Men vermoedt dat in de natuur een bepaald type moedereiwit is ontstaan door samenvoeging van tenminste twee domeinen. Het ene domein is verantwoordelijk voor het herkennen van bepaalde stofjes die de belagers maken. Door de bindingseigenschappen steeds een beetje te veranderen, kon dit domein steeds een andere ziekteverwekker herkennen. Een tweede domein zorgt ervoor dat er een signaal wordt doorgegeven naar de cellen zodat de plant of bacterie een afweerreactie in gang zet.

Al die drie-dimensionale structuren brengen ook het ontwerpen van medicijnen dichterbij. Chemicus dr. P. Grootenhuis, werkzaam bij het farmaceutisch bedrijf N.V. Organon in Oss, heeft samen met prof.dr. C. van Boeckel onlangs een nieuwe klasse van synthetische suikers ontworpen die binden aan het eiwit antitrombine. De suiker-antitrombinecomplexen remmen de bloedstollingseiwitten trombine en factor Xa, waardoor de bloedstolling wordt geremd. Dat kan belangrijk zijn na operaties, wanneer bloedstolsels moeten worden voorkomen. Nu wordt hiervoor nog heparine (chemisch gezien een suiker) toegediend, dat wordt geïsoleerd uit dierlijke organen. Een kleine synthetische suiker penta-saccharide is in klinisch onderzoek.

Met een speciale bril op, zien we op het computerscherm prachtig de drie-dimensionale vouwing van het antitrombine uit de computer steken. Tegen het eiwit is ook de structuur van een suikermolecuul gemodelleerd. De vele kleine, paarse streepjes stellen de atomen in het eiwit voor; de oranje streepjes die in de suiker. Even later veranderen de kleuren. Waar het nu rood is, legt Grootenhuis uit, zijn groepen negatief geladen, blauw geeft positief geladen groepen aan, en wit en geel staan voor ongeladen groepen. Op het scherm is precies te zien waar negatief geladen suikergroepen binden aan de positieve aminozuren van de eiwitten. Met weer een klik op de muis, is aan stippellijntjes te zien waar zogeheten waterstofbruggen worden gevormd tussen suiker en eiwit.

Vervolgens verschijnt op het scherm het eiwit antitrombine, gebonden aan het eiwit trombine. 'Bij dit model kwamen wij ineens op het idee om het synthetische penta-saccharide te verlengen', verklaart de chemicus. Duidelijk is te zien hoe een verlenging van de suikerketen een verbinding vormt tussen de eiwitten trombine en antitrombine. Bij de vraag hoe zo'n nieuwe suiker er precies uit moet zien helpen computerprogramma's. Zij berekenen welk type suikerketen waarschijnlijk het beste bindt aan het eiwitcomplex. De suikerdeskundige gaat vervolgens aan de slag om het suiker te maken.

Daarmee is dit medicijn er overigens nog niet: 'Er komt nog steeds veel trial and error aan te pas', weet Grootenhuis, 'het synthetische suiker kan overwachte bijwerkingen hebben, het kan te snel worden afgebroken, of het wordt misschien slecht opgenomen. Maar zonder de driedimensionale structuur zouden we niet weten aan welke kant je dit penta-saccharide moest verlengen.'

Molecular modelling aan eiwitten is nu zo'n tien jaar oud. Bij deze techniek haalt de computerchemicus, zoals hij of zij tegenwoordig heet, eiwit- en eventueel suikerstructuren uit de data-base op het computerscherm. Op het scherm kan hij suikers laten binden aan eiwitten. Hij kan ook aminozuren vervangen door andere, en vervolgens de computer laten berekenen tot welke eiwitvouwing dit waarschijnlijk zal leiden. Dit is handig, omdat zo vouwingen kunnen worden voorspeld van onbekende eiwitten, verwant aan eiwitten wiens structuur in het laboratorium wel al is opgehelderd. Bij de berekeningen wordt gebruik gemaakt van krachtvelden. Zo is het niet waarschijnlijk dat twee negatief geladen groepen vlak bij elkaar zitten omdat die elkaar afstoten, en zo zullen twee watervrezende groepen juist wel graag elkaars buren zijn. Overigens blijken de voorspellingen nogal eens fout te zijn, omdat de programma's lang niet alle factoren meenemen.

De nieuwe klasse van synthetische suikers van Organon is een van de eerste voorbeelden, waarbij molecular modeling een rol heeft gespeeld. Te verwachten is dat de techniek belangrijker wordt. Amerikaanse farmaceutische bedrijven, zo weet Grootenhuis, proberen momenteel voortdurend allerlei stoffen uit die passen in de holte van een opgehelderde eiwitvouwing. Als zo'n stof daar goed past, dan hindert hij de functie van dat eiwit en wordt het een remmer genoemd.

Daarbij leveren echt nieuwe vouwingen ideeën voor nieuwe klassen remmers. Chemici van het NKI en het Bijvoetcentrum van de Universiteit van Utrecht hebben in september in Nature Structural Biology de drie-dimensionale stuktuur gepubliceerd van een van de drie domeinen van het eiwit integrase, dat ervoor zorgt dat het HIV-virus eigen DNA in het menselijk DNA kan zetten. De structuur leerde ondermeer dat de eiwitten paarsgewijs aan elkaar zitten. De chemici stellen daarop voor om remmers te maken die dit samenvoegen voorkomt.

Sommige biochemici voorspellen dat binnen twintig jaar alle eiwitdomeinen die de natuur kent, zijn opgehelderd - mét de functies die ze hebben. De biotechnologen hebben dan al die domeinen in hun blokkendoos, waarmee ze steeds weer nieuwe eiwitten en remmers bouwen. Ze zoeken bij domeinen remmers die precies in de holtes passen. Of ze pakken een domein dat aan vetten van celmembranen hecht, zetten er een domein bovenop dat bindt aan een signaaleiwit, daaraan nog eens een domein dat energie-drager ATP omzet, en tenslotte een domein dat bindt aan een ziekteverwekker. Van dit laatste hebben ze de bindingseigenschappen verbeterd door wat aminozuren te veranderen. De stukken DNA, coderend voor de domeinen, maken ze aan elkaar vast, en zetten ze in planten of micro-organismen. Precies zoals de natuur een miljard jaar lang ook heeft gedaan.

En de onderzoekers hopen het nog beter te doen. Dat de natuur alle eiwitvouwingen heeft uitgeprobeerd, achten de Londense biochemici in het Nature-artikel onwaarschijnlijk. Waarom dus ook niet zoeken naar nog geheel nieuwe eiwitdomeinen? 'Een stabiele vouwing maken die de natuur nog niet heeft gevonden', zo concluderen ze hun artikel, 'dat kan nog veel uitdagender zijn.'

De homepage van de protein databank is in te zien op http://www.pdp.bnl.gov/