Spiegelbeelden scheiden met een membraan

Moleculen die elkaars spiegelbeeld zijn hebben vaak verschillende biologische activiteit. In het laboratorium zijn ze moeilijk van elkaar te scheiden. Onderzoekers van Akzo Nobel hebben een methode gevonden die industrieel bruikbaar lijkt.

Het laboratorium van Akzo Nobel Central Research in Arnhem heeft octrooi aangevraagd op een methode om enantiomeren van elkaar te scheiden. Enantiomeren zijn moleculen die in vorm elkaars spiegelbeeld zijn, maar verder niet van elkaar verschillen.

De scheiding is gebaseerd op complexvorming met eveneens spiegelbeeldvormige moleculen. De vinding lijkt van groot belang voor de produktie van geneesmiddelen en pesticiden. De onderzoekers moeten de methode nog opschalen, maar de grote farmaceutische industrieën willen nu al graag weten of hun enantiomere geneesmiddelen met de nieuwe methode te scheiden zijn.

“Tot nu toe is ons dat zelfs met moeilijke moleculen gelukt,” zegt de uitvinder dr.ir. J.T.F. Keurentjes. Akzo Nobel moet nog beslissen hoe de vinding wordt gecommercialiseerd. De farmaceutische industrie zet jaarlijks voor miljarden om aan geneesmiddelen die bestaan uit spiegelbeeldvormige moleculen. Nieuwe geneesmiddelen mogen echter niet meer als mengsels van enatiomeren op de markt komen.

Enantiomeren zijn een probleem in de farmacie en een groeiende zorg voor de producenten van landbouwbestrijdingsmiddelen. Moleculen die elkaars spiegelbeeld zijn ontstaan vaak gelijktijdig en in even grote hoeveelheden bij chemische syntheses. De enantiomeren hebben hetzelfde smeltpunt, kookpunt en oplosbaarheid en zijn daarom moeilijk van elkaar te scheiden. Toch hebben ze vaak een verschillende biologische activiteit. Dat komt doordat de meeste biomoleculen in de cel slechts in een van beide spiegelbeeldvormen voorkomen.

Spiegelbeeldparen van moleculen zijn bekend onder verschillende namen. Linksdraaiende en rechtsdraaiende moleculen heten ze wel, omdat ze opgelost in water gepolariseerd licht links- of rechtsom draaien. Stereo-isomeren worden ze ook genoemd, omdat het vormverschil te maken heeft met de ruimtelijke rangschikking van atoom- en molecuulgroepen. Een mengsel waarin beide enantiomeren in gelijke verhouding voorkomen heet een racemisch mengsel. Conventionele synthetische reacties leveren - in tegenstelling tot enzymatische reacties - meestal een racemisch mengsel op.

Bij geneesmiddelen kunnen beide enantiomeren werkzaam zijn. Maar soms zorgt de ene spiegelbeeldvorm voor de vervelende bijwerkingen van het geneesmiddel. Het beroemdste voorbeeld is softenon (thalidomide). Het ene enantiomeer veroorzaakt karakteristieke misvormingen bij baby's als de zwangere vrouw vroeg in de zwangerschap softenon slikt, terwijl de werking als goed slaapmiddel en pijnstiller waarschijnlijk door het andere enantiomeer wordt uitgeoefend. Het softenondrama was de aanleiding om in de Westerse wereld geneesmiddelen goed te testen voor ze op de markt kwamen.

Pas veel later is ontdekt dat softenon ook een aanleiding is om de scheiding van enantiomeren serieus te nemen. Bij gewasbestrijdingsmiddelen is vaak maar één enantiomeer biologisch actief. De helft van de gespoten stof is dan een nutteloze milieuverontreinigende ballaststof.

Moeizaam scheidingswerk

De nationale bureaus voor geneesmiddelenregistratie in de Westerse wereld zeggen al enige jaren dat ze nieuwe geneesmiddelen, als die uit racemische mengsels bestaan, niet meer op de markt willen hebben. De fabrikant die toch nog een racemisch mengsel wil registreren, moet van beide enantiomeren de farmaceutische gegevens leveren en aantonen dat een eventueel niet-genezende enantiomeer onschadelijk is. Dat betekent moeizaam scheidingswerk en geldverslindend dubbel proefdier- en patiëntenonderzoek.

De farmaceutische industrie zocht het antwoord tot nu toe in stereospecifieke synthese, waarbij slechts een van beide spiegelbeeldvormen ontstaat. Maar dat vergt een moeizame en dure synthese. Programmadirecteur Akzo-research ir. E. van Andel: “Er zijn inmiddels wel stereospecifieke syntheses, maar voor iedere stof moet weer een aparte katalysator worden ontworpen. Onze scheidingsmethode, waarmee je na conventionele chemische synthese de spiegelbeeldvormen van elkaar scheidt, is universeel toepasbaar.” En Keurentjes: “Bovendien is stereospecifieke synthese meestal niet voor 99,9% zuiver en zal er vaak voor gebruik als geneesmiddel toch nog een scheidingsstap nodig zijn.”

De scheidingsmethode van Keurentjes is opgebouwd uit relatief eenvoudige basistechnieken. Van Andel: “We ontmoetten veel ongeloof toen we onze techniek dit voorjaar op een congres over stereochemie bekend maakten. Er wordt al jarenlang intensief gezocht naar een op industriële schaal toepasbare scheidingsmethode voor enantiomeren. De insiders geloofden niet dat het zó eenvoudig is dat ze het zelf hadden kunnen bedenken.”

Geheim

De Akzo-Nobel-onderzoekers scheiden de enantiomeren over een membraan. Het racemisch mengsel wordt ingespoten in een oplossing van de hulpstof dihexyltartraat in heptaan en stroomt dan langs een met water verzadigd membraan waarlangs aan de andere kant eveneens heptaan met dihexyltartraat stroomt. Het geheim is dat het dihexyltartraat aan de ene kant van het membraan de spiegelbeeldvorm is van het dihexyltartraat aan de andere kant.

Keurentjes: “Cruciaal is dat een enantiomeer van de te scheiden stof iets beter oplost aan de ene kant van het membraan dan aan de andere kant. Dat is een gevolg van vormspecifieke complexvorming met de hulpstof dihexyltartraat.”

Heptaan bestaat uit een rechte keten van zeven koolstofatomen met daaraan 16 gebonden atomen waterstof. Het is een vloeistof, een bestanddeel van benzine waar water slecht en vetten goed in oplossen. Dihexyltartraat is gemaakt van wijnsteenzuur (COOH-CHOH-CHOH-COOH). Het zuur lost goed op in water, maar niet in heptaan. Door aan beide uiteinden hexylstaarten vast zetten, ontstaat dihexyltartraat dat wel goed in heptaan oplost. Keurentjes: “De stoffen die we willen scheiden zijn meestal zuren of basen die makkelijk in water oplossen. Ze lossen op in de vetachtige heptaan-dihexyltartraatoplossing dank zij de vier polaire zuurstofgroepen in het wijnsteenzuur. De te scheiden stoffen passeren ook makkelijk het met water verzadigde cellulosemembraan dat we gebruiken. Het heptaan en dihexyltartraat blijven steeds aan dezelfde kant van het membraan omdat ze zich onprettig voelen in de waterfase van het membraan.”

In de praktijk wordt de scheiding uitgevoerd in cilinders van 5 tot 10 centimeters diameter, waarin naast elkaar duizenden membranen in de vorm van 200 micrometer dikke slangetjes zijn bevestigd. Door bevestiging in een kunsthars aan de uiteinden van de kolom ontstaan er twee vloeistofcompartimenten: een binnen de vezel en een buiten de vezel. Ieder vloeistofcompartiment heeft eigen in- en uitstroomopeningen.

Van Andel: “Het zijn de membranen van gemodificeerd cellulose die wij in zeer groten getale maken voor kunstnieren in onze fabriek in Wuppertal. De eerste scheidingsexperimenten hebben we in die kunstnierkolommen uitgevoerd. Tegenwoordig gebruiken we aangepaste kolommen.”

Net als in een kunstnier lopen beide vloeistoffen in tegenstroom door de koker. In een kunstnier kunnen alleen kleine moleculen (zouten en eiwitafbraakresten) het membraan passeren en berust de scheiding op diffusie en osmose. Bij de enantiomeerscheiding kunnen alle aanwezige moleculen het membraan passeren. De vetachtige stoffen (het oplosmiddel heptaan en het dihexyltartraat) blijven echter uit de buurt van het water waarmee het membraan is verzadigd. De geneesmiddelen passeren het membraan vaak en ongehinderd, maar de ene enantiomeer heeft een lichte voorkeur voor verblijf aan een zijde door de betere complexvorming met een van beide enantiomeren van de hulpstof dihexyltartraat.

Typisch Nederlands

Technisch kon de kolom verder worden verbeterd door introductie van de dubbele tegenstroom. De te scheiden stof wordt niet aan het uiteinde, maar in het midden van een kolom met membraanvezels gebracht waarin het heptaan met de twee enantiomeren van dihexyltartraat in tegenovergestelde richting stromen. Keurentjes: “In de kolom ontstaat een verdelingsevenwicht waarin door herhaaldelijke membraanpassages veel van de te scheiden stof een tijdje in de buurt het injectiepunt circuleert. Stroomafwaarts wordt de invloed van de complexvorming merkbaar. Op ieder punt in de kolom zit de ene enantiomeer 1,1 tot 1,2 keer zo graag aan de ene kant als aan de andere kant van het membraan. Bij een goed gekozen kolomhoogte en -breedte stroomt de ene component gezuiverd bovenuit de kolom en de andere spiegelbeeldvorm van onderen. We kunnen nu in een kolom van een meter hoog een zuiverheid van meer dan 99,9% bereiken. De gescheiden enantiomeren kunnen we vervolgens eenvoudig uit het heptaan terugwinnen.”

Toen Keurentjes vier jaar geleden na zijn promotie aan de Landbouwuniversiteit Wageningen bij Akzo Nobel binnen kwam, probeerde hij de enantiomeerscheiding allereerst met water en enantiomeren van melkzuur als hulpstof. Van Andel: “Melkzuur en water, een typisch Nederlandse aanpak. Het principe was goed, maar de scheiding berust vooral op het aangaan van waterstofbruggen tussen de complexvormende enantiomeren. In water en melkzuur zijn veel te veel waterstofbruggen aanwezig om de invloed van de spiegelbeeldmoleculen nog te merken.”

Keurentjes: “Toen we eenmaal de vetachtige omgeving van heptaan en dihexyltartraat hadden bedacht, had ik binnen twee weken resultaat.” De vier zuurstofatomen in het wijnsteenzuur, en hun verschillende oriëntatie bij de twee gebruikte stereo-isomeren blijken bepalend voor de complexvorming met de te scheiden verbindingen. Elektrische (Coulomb)-interacties en Van der Waalskrachten spelen een ondergeschikte rol in de complexvorming tussen de moleculen.

De Akzo-Nobel-onderzoekers weten nu zoveel van het proces dat ze met computerberekeningen aan molecuulmodellen kunnen voorspellen hoe goed een bepaald racemisch mengsel met dihexyltartraat kan worden gescheiden.

Keurentjes is het proces verder aan het optimaliseren. De natte membraanvezels in de waterafstotende (lipofiele) omgeving kleefden aanvankelijk tegen elkaar, wat de uitwisseling over het membraan verslechterde. Door de vezels op meer plaatsen in de kolom te fixeren werd dat probleem opgelost. Keurentjes: “Nog steeds wordt de scheiding niet door de diffusieconstante, maar door de geometrie van de kolom bepaald. Theoretisch kan het nog veel beter.”

Dat moet ook wel want met de kolommen die nu werken kunnen de onderzoekers kilo's materiaal per jaar scheiden. Voor een goedlopend geneesmiddel wil een farmaceutische industrie een kolom die tonnen per jaar aan kan. En als ook de gewasbeschermers interesse krijgen voor een licentievergunning moeten er kolommen komen die duizenden tonnen per jaar kunnen verwerken. Keurentjes: “Ik weet niet of we dat halen, maar binnen anderhalf tot twee meter lange pijpen met een diameter van 10 centimeter moet het meeste kunnen, volgens onze berekeningen.”

En de markt is groot. Keurentjes: “Ongeveer 450 chemicaliën, met een marktgrootte van miljarden dollars, zijn als racemisch mengsel verwerkt in geneesmiddelen. Van de 1.800 chemische verbinding die als geneesmiddel zijn geregistreerd zijn er 600 die een spiegelbeeldvorm hebben. En 150 daarvan zijn al als aparte enantiomeer op de markt. Dat zijn stoffen die door enzymen in bacteriën, planten of dieren worden gemaakt, of die in een stereospecifieke synthese ontstaat.”

Van Andel: “Het is niet gezegd dat die 450 bestaande middelen nu ook gescheiden worden. In de meeste gevallen zal dat commercieel niet interessant zijn omdat de patenten verlopen zijn. Fabrikanten zullen vooral geïnteresseerd zijn in de scheiding van nieuwe middelen, waar patent op zit.”

Wat er commercieel ook van de methode wordt, aardig is dat wijnsteenzuur aan de basis staat. De grote natuurwetenschappelijk experimentator Pasteur ontdekte in 1848 dat wijnsteenzuur neerslaat in twee kristalvormen die elkaars spiegelbeeld zijn. Hij scheidde de kristallen met een pincetje, loste ze apart op in water en vond dat de ene oplossing gepolariseerd linksom draait en de andere oplossing een rechtse draaiing veroorzaakt. Pasteur had daarmee de eerste en tot voor kort enige scheidingsmethode voor enantiomeren gevonden.

In 1874 legden de Nederlandse chemicus Jacob van 't Hoff en de Fransman Joseph Le Bel het het verband tussen de vier mogelijke bindingen van koolstof en de moleculaire spiegelbeeldvormen. Als theoretische verklaring postuleerden zij de tetraëdische omringing van vierwaardig koolstof die later ook experimenteel bevestigd is. Na Pasteur hebben velen geprobeerd om enantiomeren van elkaar te scheiden, maar pas nu, 145 jaar later, is het Keurentjes en Van Andel gelukt.