Meeste erfelijke trombose gevolg van fout in al lang bekend eiwit

Leidse hematologen hebben een mutatie in een gen opgespoord die de helft van alle erfelijk bepaalde tromboses veroorzaakt, ofwel een vijfde van alle tromboses.

Trombose is een veel voorkomende ziekte: ongeveer 1 op de 1.000 Nederlanders krijgt jaarlijks een bloedstolsel in aderen, longen of hersenen. Het gevolg: last, invaliditeit of de dood. De ziekte treedt zelden spontaan op. Bekende risicofactoren zijn operaties, bevallingen, ernstige ziekten en langdurige bedlegerigheid. Biochemicus prof.dr. R.M. Bertina, verbonden aan de vakgroep hematologie van het AZ Leiden: “Al heel lang is bekend dat in sommige families veel mensen trombose krijgen. Toch is het onderzoek naar de oorzaak van trombose maar langzaam op gang gekomen, vooral door het ontbreken van objectieve diagnostiek en bruikbare laboratoriumtests.”

De Leidse hematologen, bijgestaan door klinisch epidemiologen, publiceren hun vondst van de risicoverhogende genmutatie in Nature van vandaag (5 mei). Eind december 1993 betekende een artikel in The Lancet het eerste grote resultaat van hun onderzoek, dat eigenlijk een zijweggetje is van langlopend en systematisch opgezet werk.

De zijweg werd pas ingeslagen nadat in februari 1993 de Zweedse biochemicus Björn Dahlbäck een nieuwe laboratoriumtest beschreef waarmee een specifieke patiëntengroep kon worden opgespoord. Door alert te reageren waren de Leide onderzoekers in staat om - met klaarliggende gegevens - de aandoening van die patiënten tot op genniveau te beschrijven. Dit onderzoek laat zien wat in de toekomst mogelijk wordt, als het Human Genome Project tot een afronding komt en de basevolgorde in alle menselijke genen beschikbaar is.

Dahlbäcks test identificeert mensen met een schijnbaar vertraagde werking van geactiveerd proteïne C (activated protein C, of APC). APC is een enzym dat de bloedstolling tegen gaat. In de vele enzymatische reactiestappen die tot samenklonterende bloedplaatjes - en dus tot bloedstolling - leiden, knipt APC twee hulpeiwitten, factor V en factor VIII, kapot.

In een gezond individu is bloedstolling steeds in delicaat evenwicht met ontstolling. Na beschadiging van een bloedvat ontstaan aanvankelijk spoortjes trombine, een enzym dat tot de vorming een onoplosbaar fibrinestolsel aanzet. Trombine heeft nog twee functies. Het activeert zijn eigen produktie en verhoogt daartoe de activiteit van de stollingscascade, een serie opeenvolgende reacties die tot bloedstolling leidt. Een aantal daarbij betrokken hulpeiwitten zoals factor V en VIII worden dan duizend maal zo actief. Met enige vertraging zet trombine ook proteïne C om in geactiveerd proteïne C, dat de stollingscascade weer onderbreekt.

Trombosefamilies

Proteïne C werkt alleen als er een cofactor proteïne S aanwezig is. Families waarbinnen door een erfelijk defect een van beide eiwitten missen waren al bekend als 'trombosefamilies'. Ook mensen waar het gen voor het eiwit antitrombine III kapot is, behoorden tot de bekende trombose-overervers. Maar die gendefecten verklaarden slechts 20% van alle familiale tromboses.

Promovendus Ted Koster, arts-onderzoeker bij klinische epidemiologie, was begin 1993 met dr. F.R. Rosendaal al drie jaar bezig met de Leidse Trombophilia Studie (LETS), toen Dahlbäck zijn nieuwe laboratoriumtest voor het meten van APC-gevoeligheid publiceerde. Daarvoor had hij 300 mensen met een eerste trombosebeen en 300 gezonde controlepersonen onderzocht en bloed afgenomen. Koster: “Onze onderzoeksgroep was bijzonder geschikt om de kans op trombose te relateren aan de uitslag van de APC-gevoeligheidstest. Naspeuring of elders ter wereld hematologen dat ook al deden, leverde niet direct concurrenten op. Alleen Dahlbäck en de Zweedse hematologen waar hij mee samenwerkt konden al een voorsprong hebben, maar op een groot hematologiecongres vorig jaar juli in New York bleek dat Dahlbäck niet zo'n mooie patiëntenpopulatie had. Ik ben toen snel begonnen.”

Door de honderden ingevroren bloedmonsters van patiënten en controles stuk voor stuk aan de APC-sensitiviteitstest te onderwerpen, vond Koster dat 21% van de trombosepatiënten een slechte APC-gevoeligheid hadden, tegen 5% van de mensen in de controlegroep die qua leeftijd en geslacht gelijk waren aan de patiënten, maar geen trombose hadden gehad. Van de tien patiënten waarvan ook de ouders waren onderzocht hadden er negen een ouder met eveneens ongevoelig APC. Van tien mensen uit de controlegroep met normale APC-gevoeligheid had slechts één een ouder met ongevoelig APC. Hoe trager de werking van geactiveerd proteïne C, hoe groter ook de kans op trombose. De Leidse groep wijt de verlaagde APC-gevoeligheid aan een dominant erfelijke aandoening die niet op een geslachtschromosoom overerft en een zevenmaal grotere kans op trombose geeft. Ze postuleerden dat de patiënten met de slechtste APC-score homozygoot zijn voor de afwijking, wat wil zeggen dat bij hen beide exemplaren van het gen gemuteerd zijn.

Koster was in september klaar met de analyse van alle patiënten en controles. De publicatie verscheen in het laatste decembernummer van The Lancet. Twee maanden later verscheen Dahlbäck's artikel in The New England Journal of Medicine. Vriend en vijand vinden het Leidse onderzoek methodologisch veel mooier dan dat van Dahlbäck.

Nadat de uitslag van de Dahlbäcktest was gerelateerd aan de kans op trombose, begon de speurtocht naar het verantwoordelijke gen en de trombose-bevorderende gen-afwijking. Ook op dat gebied was Dahlbäck al actief. Halverwege 1993 had hij gepostuleerd dat er een nieuwe co-factor voor proteïne C in het spel moest zijn. Bertina: “We geloofden daar niet in. Vanaf de jaren zestig zijn successievelijk alle eiwitten van het stollingssysteem ontdekt. We konden ons moeilijk voorstellen dat er nog meer nodig waren.”

Voorzichtigheidshalve werd in de zoekstrategie zowel met een onbekend als met een bekend eiwit rekening gehouden. De klassieke genspeurtocht, als geen eiwit bekend is, begint met familie-onderzoek en DNA-merkers waarvan de precieze lokatie op het chromosomaal DNA bekend is. De globale plaats van een ziektegen is gevonden als een merker opduikt die niet bij gezonde familieleden overerft, maar wel bij familieleden met de aandoening. Bertina: “Onderzoek bij een grote trombosefamilie met een vijftigtal personen wees naar chromosoom 1, naar een gebied waar het gen voor factor V ligt, een van de twee hulpeiwitten in de stollingscascade waar APC invloed op heeft.”

Ondertussen was ook een oude hematologische diagnostiekmethode van stal gehaald. Bertina: “Bij patiënten met een stollingsziekte weet je aanvankelijk niet welke stollingsfactor een rol speelt bij de ziekte. Door geïsoleerde stollingsfactoren aan het plasma van de patiënten toe te voegen, of door het patiënteplasma te mengen met plasma waar stollingsfactoren uit zijn gehaald, kun je mengsels maken waar van bepaalde stollingsfactoren niets, of juist veel in zit. Een logisch samengestelde reeks van zulke plasmamonsters hebben we getest op de werkzaamheid van geactiveerd proteïne C.”

Bloed van een homozygote patiënt met een dramatisch lage score op de Dahlbäcktest scoorde in die mengtest net zo als een bloedmonster van een gezond mens waar de stollingsfactor V uit was verwijderd. Toevoegen van hoog gezuiverd factor V aan het bloed van de homozygote patiënt herstelde de werking van geactiveerd proteïne C. Bertina: “In combinatie met enkele andere mengproeven was voor ons het bewijs geleverd dat de gepostuleerde cofactor niet bestaat, maar dat we op zoek waren naar een genetisch defect in factor V. Proteïne C is dus zelf in orde. Normaal gesproken knipt APC factor V en VIII. In factor V is nu iets mis waardoor APC niet meer kan knippen.”

Factor V is een reuze-eiwit van 2200 aminozuren. Bertina: “Gelukkig is er al veel bekend van factor V. Onze moleculair bioloog dr. Reitsma is daarom eerst gaan kijken naar plaatsen in het gen die coderen voor de aminozuurvolgorden waar APC bindt en knipt. Op de knipplaats was het raak. In basepaar 1691 zit normaal een guanine, maar die was bij een homozygote patiënt vervangen door adenosine. In de aminozuurketen verandert daardoor een arginine in glutamine. Daardoor kan APC het geactiveerde factor V niet knippen en wordt eenmaal geactiveerd factor V in de stollingscascade nooit meer uitgezet. De stollingsactiviteit blijft daardoor veel te lang hoog.”

De mutatie op positie 1691 was de enige die in een flink gebied van 500 baseparen rond de knip- en bindingsplaatsen van APC aan factor V werd gevonden. Bovendien werd dezelfde mutatie gevonden in vrijwel alle patiënten en controles die ongevoelig waren voor APC. Daarmee is deze afwijking, die bljkt voor te komen bij 1 op de 25 mensen, veruit de belangrijkste erfelijke afwijking voor trombose.

Deze ongekend snelle speurtocht naar een genmutatie slaagde door een samenloop van omstandigheden. Bertina: “Het patiëntenmateriaal lag klaar, en in Leiden bestond al veel kennis over de stollings- en ontstollingseiwitten en hun genen. Het is echter de intensieve samenwerking tussen artsen, biochemici en moleculair-biologen van de afdelingen hematologie en klinische epidemiologie die ons onderzoek zo succesvol maakten.” De redactie van van Nature vond de methode zo origineel dat het artikel voor publicatie werd geaccepteerd. Een eer die niet meer voor veel gevonden genafwijkingen is weggelegd.

Wat de nieuwe vondst voor de praktijk in het ziekenhuis gaat betekenen, weten de Leidse hematologen nog niet. T. Koster: “Het is in de meeste ziekenhuizen al gangbaar om in de zes weken na een grote operatie - bijvoorbeeld heupoperaties - de patiënt middelen te geven die de bloedstolling vertragen. Die praktijk bestaat al, dus waarom zou je mensen testen op hun gevoeligheid voor trombose voor zo'n ingreep?” Bertina: “Antistolling heeft een schaduwzijde, het verhoogt soms de kans op bloedingen. Trombose is een aandoening met multifactoriële oorzaak, zodat je per individu, ook binnen erfelijk belaste families een behandelingsadvies moet geven.”