65.000 chemische reacties op een postzegel

Voor het testen van nieuwe farmaceutica is verregaande automatisering noodzakelijk. Technieken uit de chipsfabricage brengen uitkomst.

Jaarlijks worden talloze verbindingen getest voor de ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen. De combinatiemogelijkheden zijn eindeloos. Alleen al om de groep hexapeptiden te testen is een schier onmogelijke opgave. Hexapeptiden zijn korte peptieden die uit uit zes aminozuren bestaan en zich selectief aan moleculen kunnen hechten. Met twintig verschillende aminozuren kunnen hexapeptiden wel op 64 miljoen manieren worden samengesteld.

Uit onderzoek blijkt dat van de 10.000 onderzochte componenten er gemiddeld maar één over de gewenste eigenschappen beschikt. Het ontbreekt de industrie aan technieken waarmee snel duizenden componenten tegelijk kunnen worden getest.

Een van de methoden om het analyseren van chemische samenstellingen te vereenvoudigen is geïnspireerd door de halfgeleiderindustrie. Chips waarop miljoenen schakelingen zijn aangebracht worden VLSI-chips genoemd. De afkorting staat voor Very Large Scale Integration.

De firma Affymax uit Palo Alto (Californië) heeft hierop een "moleculaire' variant bedacht: VLSIPS (Very Large Scale Immobilized Polymer Synthesis). Op een silicium plaatje ter grootte van een postzegel (1,28 cm) zijn tienduizenden componenten samengebracht. Dat kunnen peptiden, suikers of DNA-ketens zijn. Deze componenten kunnen in verschillende variaties uit losse aminozuren of nucleïnezuren worden samengesteld.

Dat gaat als volgt: eerst wordt de chip voorzien van een lichtgevoelige chemische beschermlaag (nitroveratryloxycarbonyl). Daaroverheen wordt, net als bij de produktie van siliciumchips, een lithografisch masker met zeer kleine gaatjes geplaatst. Vervolgens wordt de chip met laserlicht beschenen. Op die plekken waar het licht via het masker de chip raakt verdwijnt de beschermlaag. Een reagens met aminozuren of nucleïnezuren wordt over de chip gesprenkeld. De moleculen hechten zich automatich aan lokaties waar de beschermlaag is verdwenen.

Dit computergestuurde proces kan met diverse maskers eindeloos herhaald worden, net zolang totdat de chip met 65.000 peptide-torentjes of stukjes DNA is volgebouwd. De chip oogt dan als een mini-dambord met zeer kleine vlakjes, sommige niet groter dan tien tot honderd vierkante micron. Zitten de peptiden eenmaal op hun plaats, dan kan hun biochemische activiteit worden onderzocht door de chip te overgieten met een reagens waarin zich antilichamen of enzymen bevinden.

Sommige van deze werkzame stoffen zullen zich aan de peptiden hechten, andere niet. Deze reacties kunnen met behulp van een fluorescerende kleurstof visueel worden waargenomen. Een laserstraal tast in enkele minuten de 65.000 lokaties af en meldt aan een computer waar op de chip een succesvol biochemisch "rendez-vous' heeft plaatsgevonden. Die gegevens worden tenslotte in een overzichtelijk diagram gezet. Zo kunnen vrij snel kandidaatmoleculen voor geneesmiddelen worden geselecteerd. "Slap it in and see' noemt men dit proces.

Zeven jaar oud

VLSIPS is het geesteskind van Alejandro Zaffaroni, de oprichter van bekende farmaceutische ondernemingen als Syntex (de fabrikant van de pil) en het aan Schering-Plough verkochte biotechbedrijf DNAX. "Alejandro was zijn tijd ver vooruit,' zegt Affymax-directeur John D. Diekman. "Hij zag hoe ineffciënt farmaceutische bedrijven werken. Het concept van VLSIPS was eigenlijk vrij snel verzonnen. We hoefden er zelfs geen speciale apparatuur voor te ontwerpen. Sterker nog: de hardware die we gebruiken is minstens zeven jaar oud. Fotolithografiemaskers worden in de halfgeleiderindustrie immers al tientallen jaren gebruikt. Het enige wat we hebben moeten ontwikkelen is de software.'

Het grote voordeel van de methode van Affymax is dat het "screenen' van stoffen veel sneller gaat dan met andere technieken. Want die zijn er. Het automatisch synthetiseren van nucleotidensequenties bijvoorbeeld is al niets bijzonders meer. De DNA-synthesizer, een vertrouwde verschijning in laboratoria, doet dit tegenwoordig in een handomdraai. Het vervaardigen van oligodesoxynucleotiden (kortweg oligo's) is een kwestie van de gewenste basenvolgorde intoetsen.

Voor peptide-synthese bestaan ook verschillende mogelijkheden. Affimax' grootste concurrent Selectide uit Tucson (Arizona) maakt gebruik van piepkleine kraaltjes, waarop peptiden worden "gekweekt'. Men begint met één aminozuur en voegt daar - in verschillende combinaties - telkens nieuwe aminozuren aan toe door de kraaltjes door elkaar te husselen en weer te scheiden. Dipeptiden (peptiden met twee aminozuren) worden tripeptiden (drie aminozuren) en tenslotte hexapeptiden. Het "screenen' van deze peptiden lijkt op de methode van Affymax: een fluorescerende stof verraadt waar antilichamen of enzymen zich aan de peptiden hechten. Een andere methode - ontwikkeld door Richard Houghten van het Torrey Pines Institute for Molecular Studies in San Diego en commercieel toegepast door het biotechbedrijf Iterex - gebruikt eveneens kraaltjes voor het kweken van honderdduizenden tetrapeptiden. Die worden vervolgens in vierhonderd "theezakjes' gestopt. Aan elk zakje worden - in verschillende samenstellingen - nieuwe aminozuren toegevoegd. De peptiden worden daarna weer uit de zakjes gehaald en van de kraaltjes gescheiden.

Zo ontstaan miljoenen hexapeptiden met een verschillende aminozuurvolgorde. Heeft men na "screening' een veelbelovende peptide gevonden, dan probeert men met deze kandidaat twintig nieuwe samenstellingen uit, net zolang totdat de ideale peptide is gevonden. De methode van Iterex kost weken, die van Selectide dagen. Affymax zegt voor zijn procédé "in een maand te kunnen doen waarvoor de farmacie minstens vijf jaar nodig heeft'.

Niet oraal

Peptide-synthese is echter hooguit interessant voor de beginfase van farmaceutisch onderzoek. Als geneesmiddel zijn losse hexapeptiden niet geschikt omdat ze snel door het lichaam worden afgebroken. Ze kunnen niet oraal worden toegediend. Meestal moeten voor dit soort geneesmiddelen speciale huidpleisters worden ontwikkeld. Peptiden spelen daarentegen wel een cruciale rol bij chemische reacties tussen eiwitten. Eiwitten zijn tamelijk grote moleculen die uit honderdduizenden aminozuren bestaan. Kleine eiwitfragmenten kunnen als bindingsplaatsen, een soort aanlegsteigertjes, voor signaalstoffen fungeren. Sommige van deze stoffen veroorzaken heftige ontstekingsreacties als zij zich aan de eiwitreceptoren van lichaamscellen hechten. Maar is de bindingsplaats bekend, dan kan met zogenaamde receptor antagonisten dit soort reacties voorkomen worden. Zij zorgen ervoor dat de signaalstof de aanlegstijger niet kan bereiken.

Voor snelle identificatie van de bindingsplaatsen hebben Affymax en ook het biotechbedrijf Chiron/Cetus een aparte techniek ontwikkeld, Recombinant Peptide Diversiteit (RPD).

Bacteriofagen

In bacteriofagen, virussen die bacteriën kunnen infecteren, worden willekeurige DNA-segmenten ingebracht die coderen voor een specifieke "peptide-staart'. Fagen bestaan hoofdzakelijk uit DNA met een omhulsel van eiwit. Met deze staart kunnen de fagen zich heel snel aan peptide-segmenten van receptoren hechten. Affymax doet onderzoek naar verschillende receptoren. Samen met farmaceutische ondernemingen als Marion Merrell Dow, Ciba Geigy en Johnson & Johnson kijkt men naar Tumor necrose factor (het bedrijf verwacht een makkelijker toe te dienen geneesmiddel tegen sepsis te kunnen ontwikkelen dan de natuurlijke interleukine-1-receptor antagonist van Synergen), MMP-7 (kanker), de trombase-receptor (hartziekten), ELAM-1 en stromelysine (artritis, osteoporose), MHC klasse II (auto-immuunziekten) en IL-2 receptor.

De VLSIPS-technologie kent nóg een belangrijke toepassing: de bepaling van de basenvolgorde van het DNA ten behoeve van het Menselijk Genoom Project. Wetenschappers hopen de komende vijftien jaar zo'n 100.000 genen te kunnen identificeren, waaronder 3000 tot 4000 genen die coderen voor erfelijke ziekten. Maar daarvoor moet men wel eerst de volgorde van de basen of componenten van het DNA kennen. Dit "sequencen' gaat op dit moment erg langzaam. In het kader van een Eureka-project zijn al wel robots ontwikkeld die 24 uur per dag kleine porties DNA van elk tweeduizend nucleotiden kunnen analyseren, maar dat schiet nog niet erg op. Het menselijk genoom bevat namelijk zo'n 3 miljard basen. Met de huidige technologie zou men minstens twaalf jaar nodig hebben om het volledige genoom in kaart te brengen en dat gaat de samenleving al gauw miljarden dollars kosten. Een aantal Japanse bedrijven werkt al wel gezamenlijk aan een sequencing-apparaat dat een fragment van een miljoen basen lang in één dag moet kunnen analyseren.

Hybridisatie

Een van de technieken waarvan gebruik kan worden gemaakt is hybridisatie. Enkelvoudige DNA-ketens kunnen in een duplexstructuur worden gekoppeld aan andere enkelvoudige, gedeeltelijk complementaire DNA-ketens. De vorming van dergelijke hybriden is echter alleen mogelijk wanneer er voldoende complementariteit tussen beide DNA-ketens kan worden gevormd. Het is een vorm van moleculaire tekstvergelijking waarbij gemerkte "probes' of sondes (korte stukjes DNA met een bekende basen- of woordvolgorde) op zoek gaan naar "soortgenoten' in de moleculaire lettersoep. De kunst is om zoveel mogelijk "probes' bij elkaar te brengen.

Onderzoekers van het Argonne National Laboratory in Illinois en Caltech in Pasadena hebben voorgesteld (Science Vol. 260, pag. 1649) om hiervoor filters van 8 x 12 centimeter te gebruiken. Theoretisch zouden alle denkbare DNA-probes op een serie filters kunnen worden aangebracht. Computers zouden aan de hand van hybridisatie-scores de structuur van onbekende DNA-fragmenten kunnen reconstrueren. Voor het herkennen van de basenvolgordes worden nog steeds nieuwe rekenmethoden ontwikkeld.

Onderzoekers van IBM hebben volgens de New Scientist van 7 augustus een algoritme geïntroduceerd dat Flash wordt genoemd (Fast Lookup Algorithm Sequence Homology). Het vergelijkt DNA-ketens met geïndexeerde DNA-fragmenten in een gegevensbestand. Het indexeren heeft als voordeel dat een basenvolgorde sneller zijn complementaire evenknie zal vinden. Het werkt een beetje zoals de indeling van een bibliotheek: een boek over hartziekten is sneller gevonden wanneer het tussen de medische boeken staat en niet is weggestopt tussen boeken die uitsluitend alfabetisch zijn gerangschikt. Met behulp van een RS/6000 werkstation van IBM kan de basenvolgorde van DNA volgens de onderzoekers nu in seconden bepaald worden.

Van dit soort technieken zou Affymax, dat tienduizenden probes op zijn chip kweekt, alleen maar kunnen profiteren. Het bedrijf wil de chip namelijk ook voor diagnostische doeleinden gaan gebruiken. Op het plaatje zouden bijvoorbeeld alle DNA-segmenten kunnen worden "gelijmd' waarvan bekend is dat ze coderen voor cystische fibrose. Er is dan in principe maar één enkele screeningtest nodig om na te gaan of iemand drager is van een van deze defecte genen. Zo liggen er nog meer toepassingen in het verschiet, zelfs op het gebied van de organische chemie.

Diekman: "We hebben aan de ontwikkeling van pesticiden zitten denken, maar het is bedrijfsmatig niet verstandig om je op zoveel verschillende terreinen te begeven. Dat geldt trouwens ook voor farmaceutische toepassingen. We werken samen met grote bedrijven omdat we zelf niet de marketinginstrumenten in huis hebben om geneesmiddelen op de markt te brengen.'

Toch is dat op de lange termijn wel de bedoeling. Affymax is niet alleen om fiscale redenen statutair gevestigd in Amsterdam. Het bedrijf is van plan om het klinische onderzoek naar Europa te verplaatsen. Nederland maakt als vestigingsplaats een goede kans.

    • Jan Libbenga