Opgepakt met een optisch pincet

Hoe grijpt, draait of verplaatst men een bacterie? Tot voor kort alleen met micro-mechanisch gereedschap. Nu kan het zonder aanraking: met licht.

Op het tv-beeldscherm krioelt, live in zwart-wit, een groepje algen. Bij een van hen is een wazig puntje licht te zien. De alg zwemt een fractie dichterbij en ploep, daar schiet hij ineens naar het lichtpunt toe. Hij wordt ernaar toegetrokken als een stukje ijzervijlsel naar een elektromagneet. Eenmaal gevangen, blijft hij gevangen. Niet in staat om zijn "random walk' te vervolgen, kan hij alleen nog maar hulpeloos tollen en spartelen. Beweegt het lichtpunt, dan gaat de alg onverbiddelijk mee.

De opstelling waarvan het beeldscherm deel uitmaakt, heet een optisch pincet. Het apparaat staat in het laboratorium van de afdeling Moleculaire Celbiologie van de Universiteit van Amsterdam. Wereldwijd zijn er maar zeven andere plaatsen waar het instrument wordt verfijnd en verder ontwikkeld.

Leider van het projekt, is dr. G.J. Brakenhoff, een fysicus die zich al vele jaren bezighoudt met het bedenken en bouwen van optisch gereedschap ten behoeve van de biologie. In de jaren tachtig was Brakenhoff een van de breinen achter de ontwikkeling van de Confocale Scanning Licht Microscoop (CSLM), een speciale microscoop waarmee levend materiaal in drie dimensies kan worden bekeken. CSLM's voorzagen in een behoefte en zijn inmiddels ook commercieel verkrijgbaar. Het zelfde succesvolle lot zou, hoopt Brakenhoff, ook het optisch pincet beschoren kunnen zijn. Samen met zijn promovendus Koen Visscher tracht de bedreven opticus, gesteund door een onderzoekssubsidie van de Stichting Technische Wetenschappen, het optisch pincet te transformeren van een experimenteel stuk speelgoed tot een praktisch bruikbaar en gemakkelijk te bedienen instrument.

Mechanische middelen

Micromanipulatie speelt in de microbiologie een steeds belangrijker rol. In plaats van passief door een microscoop te kijken, willen steeds meer onderzoekers ook kunnen ingrijpen in het stukje microwereld dat ze zien. Om een veelbelovende mutant uit te selecteren bijvoorbeeld. Of om twee algen met elkaar in contact te brengen voor een kruising.

Tot voor kort kon voor micromanipulatie alleen maar worden gebruikgemaakt van mechanische middelen. Dat wil zeggen: glasnaalden, micropipetten of ander ultradun gereedschap. Daarmee kunnen cellen worden opzijgeduwd, voortgespleept dan wel opgezogen.

Maar sinds enkele jaren bestaan er ook methoden waarbij het beet te pakken object niet wordt aangeraakt, maar beschenen. Voorwerpjes ter grootte van bacteriën, algen of zelfs nog groter, blijken zich uitstekend optisch te laten manipuleren. Er zijn daarbij twee technieken te onderscheiden: de optische pincet en de optische kooi. Beide werken met behulp van een geconcentreerde bundel laserlicht.

Hoe is het mogelijk dat je een cel kunt grijpen en vasthouden met zoiets "immaterieels' als licht? Het klinkt als het grijpen van een pingpongbal met de bundel van een zaklantaarn. In wezen komt de techniek daar inderdaad op neer, zij het dat pingpongbal heel klein moet zijn en de zaklantaarn zeer krachtig. De truc zit hem in het verschijnsel stralingsdruk. Wanneer licht van één kant op een voorwerp schijnt, resulteert het continue bombardement van fotonen (lichtdeeltjes) in een kleine maar meetbare druk. Zoals science-fiction liefhebbers weten, is het in principe mogelijk om voor de voortstuwing van ruimteschepen van deze lichtdruk gebruik te maken: men hoeft ze alleen maar uit te rusten met enorme zeilen.

De stralingsdruk van gewoon zonlicht is veel te laag om er micro-organismen in waterig medium onder een microscoop mee te kunnen manipuleren. Maar een bundel laserlicht is al gauw een miljard maal zo intens, en dat is ruim voldoende om objecten met diameters tot enkele tientallen micrometers (duizendste millimeters) vast te pinnen.

Dat vastpinnen gebeurt met een optische truc, gebruik makend van de breking van het licht door het object. De truc werkt alleen maar voor objecten met een brekingsindex groter dan die van het omringende medium. Gelukkig behoren daartoe biologische cellen, gesuspendeerd in water. Wanneer men een cel zou beschijnen met een evenwijdige bundel laserlicht, zou men hem alleen maar wegschieten. Het opvallende licht wordt dan tweemaal gebroken bij de passage door het min of meer bolvormige object, waarna het zijdelings wegstraalt. Als gevolg van de tweede wet van Newton ("actie = min reactie') zal de cel zich naar de kant bewegen waar hij het sterkst wordt aangestraald (belicht). Dat betekent dat hij in het centrum van de laserbundel wordt getrokken en vervolgens wordt voortgestuwd door de laserbundel. Dit effect lijkt een beetje op een bekend huis-tuin-en-keukenproefje, waarbij een pingpongbal blijft hangen op een straal warme lucht uit een föhn.

Voor micromanipulatie is dit uiteraard van geen enkel nut. Maar wanneer men de laserbundel met behulp van een bolle lens focusseert, verdwijnt het licht na breking niet zijwaarts, maar in de lengte-as van de laser. Dat heeft een interessant gevolg: de cel ondervindt een kracht tegengesteld aan de richting van het gebroken licht, richting het brandpunt van de lens. Hij wordt precies naar dat brandpunt "toegezogen'.

Beschijnt men dus een bacterie of andere cel met behulp van een gefocusseerde laserbundel, dan is hij "gevangen' en kan men met hem doen wat men wil. Door de laserbundel te bewegen sleept men de bacterie mee. Dat is handig, als je uit een groepje cellen er juist één wilt pakken om bijvoorbeeld in een buisje te doen. Bovendien is het ook mogelijk om met een optisch pincet strukturen binnen de cel beet te pakken zonder de celwand te beschadigen, hetgeen met naalden uiteraard nooit mogelijk zou zijn.

Brakenhoff: ""Het basis-idee van het optische pincet werd al in de jaren zeventig ontwikkeld door de Arthur Ashkin van het Amerikaanse Bell Labs. Sinds 1982 vindt het ook toepassing als micromanipulatietechniek. Maar voor praktisch gebruik als standaardinstrument is het nog weinig geschikt. Ons onderzoek is gericht op de ontwikkeling van een veelzijdig en bruikbaar instrument.''

De opstelling van Brakenhoff en Visscher neemt een flink deel van een kamer in beslag. De gebruikte laser geeft infrarood licht af met een golflengte van 1064 nanometer. Promovendus Visscher: ""Dat leidt tot een lage hoeveelheid geabsorbeerde energie en dat is wel nodig ook, want anders richt je in levend materiaal teveel schade aan. Met blauwgroen licht zou je bijvoorbeeld plantecellen ogenblikkelijk verbranden, omdat je de chloroplasten kapotstraalt.''

Het Amsterdamse systeem onderscheidt zich van die van de internationale concurrenten door meer mogelijkheden en een groter bedieningsgemak. Om te beginnen is het "pincet' geïntegreerd met een confocale (dus drie-dimensionale) en tevens fase-contrast lichtmicroscoop, waardoor de manipulaties veel beter zijn te volgen. Een technische nieuwigheid in de microscoop zorgt er voor, dat de gescande 3D-beelden in real time op een beeldscherm te zien zijn.

Daarnaast hebben Brakenhoff en zijn promovendus een optisch systeem ontwikkeld waarmee uit één laserbundel niet minder dan zestien verschillende "pincetten' kunnen worden gegenereerd. Brakenhoff: ""Om een bacterie of een gistcel te vangen hoef je er de laserbundel niet per se de hele tijd op gericht te houden. Je kunt volstaan met periodiek belichten en als je de laserbundel goed kunt manipuleren, kun je dat heel goed op vele plaatsen tegelijk doen. Andere onderzoekers kwamen tot nu toe niet verder dan twee "pincetten' per systeem en daar hadden ze twee lasers voor nodig.''

Meerdere pincetten tegelijk betekent meer manipulatiemogelijkheden. Waar een beweeglijk micro-organisme nog wild kan ronddraaien als het met maar één pincet wordt vastgehouden, is het bij gebruik van twee pincetten die vrijheid kwijt. Draadvormige cellen of filamenten laten zich met groot gemak door drie of meer gefocusseerde laserbundels vastspelden.

Koen Visscher, die volgende maand hoopt te promoveren, laat zien hoe men op deze manier biomechanisch onderzoek kan doen naar de sterkte van cellen. Door een filament met behulp van twee optische pincetten vast te houden en de punt met behulp van een derde pincet te bewegen, kan men precies vaststellen hoe ver men de celwand door kan buigen.

Zoals met zoveel uitvindingen, is nog niet van te voren duidelijk welke toepassingen er allemaal mogelijk zijn. Het scheiden van individuele cellen op grond van vormkenmerken is één van de mogelijkheden, een andere is de bestudering van het proces van agglutinatie (aaneenkleving) van parende groene algen. Door de algen met de optische pincet vast te pinnen, kan men precies zien waar de zweepstaarten van de partners met elkaar verkleven. Men kan ze vervolgens uit elkaar proberen te trekken om de mechanische sterkte van deze contacten te onderzoeken.

Kooien

Het pincet vergroot de microscopische manipulatiemogelijkheden van de onderzoeker geweldig, maar er is een beperking: het is alleen bruikbaar bij objecten met een brekingsindex groter dan dat van het medium. Is de brekingsindex lager, dan fungeert het systeem precies tegenovergesteld: het object wordt niet vastgehouden maar juist weggeschoten. Brakenhoff en Visscher ontwikkelden een methode om ook deze objecten vast te grijpen en te manipuleren.

Het principe is eenvoudig. Een optisch pincet schiet een object met een hogere brekingsindex dan het medium weliswaar weg, maar als je de bundel nu maar heel snel in een cirkel rond het object heen beweegt, houd je hem binnen de cirkel. Maak je de cirkel kleiner, dan wordt de bewegingsruimte van het object ook kleiner, totdat het uiteindelijk helemaal door een kein cirkeltje is ingesnoerd. Deze pendant van het optisch pincet heet een "optische kooi'.

Een leuke proef die Visscher met de optische kooi kan laten zien is de versmelting van twee met vloeistof gevulde waterbolletjes in paraffine. Hij kan zelfs bolletjes met verschillende chemische oplossingen met elkaar laten fuseren. Een bolletje met een oplossing van keukenzout (NaCl) geeft, na samensmelting met een bolletje met zilvernitraat (AgNOI,3 ), een neerslag van zilverchloride (AgClI,2 ), dat onder invloedt van licht ontleedt en een zilverneerslag vormt. Deze chemische reactie, met maar 0,1 nanogram (0,1 miljardste gram) aan reactanten, is een fraai staaltje van microchemie. Volgens Brakenhoff is het in principe heel goed mogelijk om met deze techniek, die naar zijn zeggen nog gemakkelijk met een factor duizend verder kan worden geminiaturiseerd, tijdsafhankelijke reactiestudies te doen. Een mogelijke biologische toepassing is, om direct te kijken naar de uitscheidingsprodukten van een bacterie die in een dergelijk bolletje is opgesloten.

Of het optisch pincet en de optische kooi uiteindelijk, net als de CSLM, bij biologische onderzoekers aan zal slaan, hangt volgens Brakenhoff af van overtuigende wetenschappelijke toepassingen. Brakenhoff: ""Het is ons destijds gebleken dat de mensen pas enthousiast raken over een techniek zodra je ze laat zien dat ze er nuttige dingen mee kunnen doen die tot dusver op geen enkele andere manier mogelijk waren. Alleen op die manier toon je aan dat het meer is dan een leuk speeltje. Daar tegenover staat dat de belangrijkste toepassingsmogelijkheden pas uitkristalliseren naarmate het apparaat door meer mensen wordt gebruikt.''